摘要：三维结构光照显微技术(3D-SIM)在所有维度上将空间分辨率提高了一倍，广泛应用于细胞成像。然而，其时间分辨率受到限制，因为需要使用压电平台逐层移动样品进行成像，这通常会使每个体积的采集时间增加到几秒。为了解决这一局限性，Chen等人开发了三维多平面SIM(3
三维结构光照显微技术(3D-SIM)在所有维度上将空间分辨率提高了一倍，广泛应用于细胞成像。然而，其时间分辨率受到限制，因为需要使用压电平台逐层移动样品进行成像，这通常会使每个体积的采集时间增加到几秒。为了解决这一局限性，Chen等人开发了三维多平面SIM(3D-MP-SIM)，该技术同时检测多平面图像，并通过协同进化的重建算法进行重建。与传统的3D-SIM成像相比，3D-MP-SIM在体积超分辨率成像的时间分辨率上实现了大约8倍的提高，横向和轴向空间分辨率分别为约120和300 nm，快速获取显著减少了活细胞中动态结构如晚期内体成像时的运动伪影。此外，作者通过高速时间序列体积成像展示了3D-MP-SIM的能力，其速度可达每秒11个体积;展示了双色成像的可行性，观察到细胞内和细胞间器泡在三维空间中的快速且紧密的相互作用。这些结果强调了3D-MP-SIM在解释亚细胞水平和三维动态行为和相互作用方面的潜力。该工作以“Fast, three-dimensional, live-cell super-resolution imaging with multiplane structured illumination microscopy”为题发表在了NATURE PHOTONICS上。
作为细胞生物学的基本工具，荧光显微镜的分辨率受到阿贝衍射极限的限制。近年来，超分辨率显微技术的发展已经超越了这一衍射极限，使得细胞成分的观察具有卓越的分辨率，远超衍射极限。在这些技术中，SIM因其相对较低的光漂白和光毒性而被广泛用于活细胞成像，这一点已通过二维SIM和全内反射荧光SIM得到了有效验证。
SIM通过应用已知的正弦照明模式来提高分辨率，捕捉调制样本结构作为摩尔条纹。这些条纹随后经过计算处理，提取超分辨率成分并重新组装，以生成分辨率更高的图像。在空间频率域中，该方法涉及将照明模式的光学传递函数(OTF)与检测OTF进行卷积，其中OTF包含该模式中存在的频率的δ函数。为了同时提高横向和轴向分辨率，3D-SIM采用了三束干涉技术。然而，由于需要逐层地移动和成像样本，3D-SIM速度较慢，拍摄单个体积的图像可能需要数秒时间。这阻碍了快速生物过程的三维观察，并可能导致运动伪影。
为了增强体积成像能力，已引入多种策略，使用图像分割棱镜(ISP)或多焦点衍射光栅同时成像多个平面，以引入离散的光学路径长度差异。结合结构化照明，提出了多平面SIM和多焦点SIM（以下简称2D-MP-SIM和切片MF-SIM），用于同时捕捉不同深度下的多平面横向超分辨率图像。然而，它们的轴向分辨率保持不变(~500 nm)，因为超分辨轴向频谱信号无法在原始物理模型中分离和扩展。因此，重建流程仍然遵循传统的逐层处理程序，这限制了彻底检查细胞微细结构三维运动的能力。
在这里，本文介绍了一种名为3D-MP-SIM的技术，该技术通过集成三束干涉、多平面检测以及由改进物理模型驱动的协同演化的SIM重建算法，实现了快速、体积化、超分辨率成像。3D-MP-SIM的分辨率可与3D-SIM相媲美（横向~120nm；轴向~300nm），同时在活细胞中表现出更少的运动伪影。通过展示内质网(ER)的高速成像和快速细胞器接触的双色成像，强调了3D-MP-SIM在推进对活细胞动态过程理解方面的巨大潜力。
对于多平面成像，样品使用单一的三维结构图案激发，不同深度发出的荧光由两个相机同时捕。原始图像包含样品的高频谱，该频谱与照明图案的七个空间频率分量（即七个不同频率的δ函数）卷积，然后在横向和轴向上平移至宽场显微镜检测的OTF中，其轴向频率带宽为kz0（图1b)。这与传统的3D-SIM形成对比，后者在成像过程中将轴向超分辨率光谱整合到轴向扩展检测OTF中（图1c)。由于传统3D-SIM具有宽场OTF截止频率kz0与轴向图案矢量pz的累积轴向带宽（即kz0 + pz)，大约是kz0的两倍，根据奈奎斯特采样定理，这意味着需要的轴向采样率约为宽场显微镜的两倍。相比之下，3D-MP-SIM仅需与宽场模式相同的轴向采样率（图1b，c，扩展数据图1和补充注释1）。根据轴向重叠的频带，传统的三维SIM五分量分离方法仅具有横向相位偏移，不能用于从三维MP-SIM数据中提取轴向信息。因此，本文引入了额外的轴向相位偏移来构建七维分离矩阵。具体而言，除了常规的间隔为2π/5的横向相位偏移外，在照明期间还实施了间隔为π/2的另一个轴向相位偏移。
通过相位调制或光学延迟线引入轴向相移，以分离轴向频谱信号。本文首先采用了后者，该系统由一个直角棱镜和安装在压电平台上的后向反射空心顶棱镜镜组成，并将其置于空间光调制器(SLM)的共轭平面上。此外，作者实验验证了延迟线能够精确地产生所需的轴向相移。对于多平面成像，作者设计了一种光学系统，在检测路径中通过ISP分离荧光信号，并使用两台相机同时捕捉八个不同区域的图像；每个区域聚焦于样品轴向上均匀分布的不同深度（图1a，d)。生成具有高调制对比度的激发场对于SIM至关重要；在此过程中，提高调制对比度的关键步骤是将三个输入光束的偏振转换为s偏振（即垂直于入射面的线性偏振）。
这种调整是通过在定制的偏振保持二向色镜前使用高速液晶可变延迟器(HS-LCVR)和四分之一波片来实现的。同步图设计旨在有效协调SLM的图案生成、相机曝光、激光切换、HS-LCVR的操作以及压电台的移动。
为了重建3D-MP-SIM数据，两个相机同时在八个不同区域捕捉到的样本八个平面被注册为原始图像，用于后续重建。3D-MP-SIM数据的重建涉及几个关键步骤（图1e)，这些步骤与传统3D-SIM相似：光谱分离、参数估计、光谱移位和维纳滤波。然而，一个显著的区别在于±1阶光谱的处理，这部分需要进一步分为上下两部分（图1e和补充注释4）。理论上，为了分离七个组分（零阶、±2阶以及±1阶的上下部分），需要捕捉七张原始图像来求解一个七维方程组。这包括分别在轴向偏移π/2之前和之后各捕捉五张和两张额外的原始图像。尽管这一策略在模拟实验中以及使用荧光微球时被证明是有效的，但在生物样本中却导致了轻微的不连续伪影。重建图像对小扰动如噪声的敏感性归因于方程组中七维分离矩阵的高条件数。因此，作者开发了一个两步重建流程：首先，利用横向相移（类似于传统的 3D-SIM 方法）将 0、±1 和±2 级别的图像分开；接下来，利用轴向相移进一步将±1 级别的上部和下部分开（图 1e 及补充注释 4）。这种方法提高了3D-MP-SIM重建的稳健性和准确性，特别是在处理真实生物样本时，条件数较低，仅为1.4。3D-MP-SIM的另一个显著特点是，七个组件被重新定位到其原始位置，使用了包含横向模式向量pxy和独特的轴向模式向量pz的三维波矢量。为了减少卷叠伪影，这些伪影表现为图像在堆栈边缘处重现和混合，作者采用了常规3D-SIM中常用的填充策略。具体来说，在原始3D-MP-SIM数据两端各添加了四个零强度平面进行零填充。重建后，提取中间的16个平面作为最终结果。
使用上述新设计，作者利用3D-MP-SIM对直径为100nm的荧光微珠进行了成像，以评估其性能与2D-MP-SIM、切片MF-SIM和传统3D-SIM的对比。总共捕捉了30次曝光（五个横向相位×三个方向×两个轴向相位，每次10毫秒）。相比之下，在3D-MP-SIM成像后立即在同一区域进行了3D-SIM成像（五个横向相位×三个方向×十六个平面，每次10毫秒），z步长为111nm，由于油水折射率不匹配，实际上相当于92.5nm。为了进行全面比较，作者在分析中还包含了2D-MP-SIM和切片MF-SIM模式（图2a-c）。分辨率通过去相关分析量化。对于横向分辨率的估计，作者遵循推荐的协议和参数设置。然而，轴向分辨率的估计受到有限轴向平面的限制（例如，只有8或16个平面）。
为了增强轴向平面，作者将多个y-z横截面图像拼接在一起，随机排列沿轴向方向的各种横截面。尽管所有测试方法的横向分辨率都比宽场显微镜提高了两倍，但只有3D-MP-SIM实现了与3D-SIM相当的轴向分辨率提升，超过了2D-MP-SIM和切片MF-SIM（图2d、e及补充表1）。这一结果与横向和轴向半高全宽(FWHM)值的测量结果一致（扩展数据图2a和补充表2）。值得注意的是，3D-MP-SIM仅使用了3D-SIM所需曝光周期的八分之一就实现了轴向分辨率的提升。此外，3D-MP-SIM的重建模型无需将轴向干涉图案的最大条纹调制位置与图像平面对齐。因此，在3D-SIM或切片MF-SIM成像过程中，无需进行轴向平面成像所需的照明模式聚焦平面优化步骤。
在固定样本中实现了与3D-SIM相当的分辨率。为了展示3D-MP-SIM在生物样本中的能力，作者对固定U2OS细胞中的免疫标记微管进行了成像。作者发现，3D-MP-SIM在解析两个轴向分离的微管方面表现出色，性能与传统3D-SIM相当。相比之下，使用2D-MP-SIM和切片MF-SIM时，这些精细的轴向细节无法分辨；然而，宽场模式未能在轴向和横向解析微管（图2g，h)。与2D-MP-SIM和切片MF-SIM相比，3D-MP-SIM的轴向分辨率与荧光珠测量结果一致（图2i，补充图12和13以及补充表1）。结果与FWHM在横向和轴向方向上的测量结果一致，证实了3D-MP-SIM在生物样本中轴向分辨率翻倍。
作者通过成像固定COS-7细胞的线粒体外膜来评估3D-MP-SIM的性能（图2j和补充视频2）。与3D-SIM类似，3D-MP-SIM成功地从侧面和轴向描绘了外膜结构。相比之下，由于轴向分辨率不足，2D-MP-SIM和切片MF-SIM未能捕捉到这些精细细节（图2k-2m）。此外，使用宽场显微镜观察时，线粒体外膜的空心结构完全被遮挡。
重建SIM图像时，要求样本在成像过程中保持静止。然而，活细胞中亚细胞结构的移动可能会导致运动伪影，特别是对于3D-SIM而言，单个体积需要较长的成像时间。作者使用荧光蛋白mStayGold-Rab9a作为标记物，对晚期内体进行了成像（图3a和补充视频3），这些晚期内体的移动速度范围为0.2到0.5µm s−1。在3D-SIM图像中，晚期内体沿轴向截面呈现拉长的线性结构，表明在用3D-SIM成像动态结构时存在显著的运动伪影。相比之下，3D-MP-SIM在类似速度下维持了轮廓结构，并表现出最小的运动伪影效应（图3b，c)。这些发现通过作者的模拟得到了验证，显示了3D-MP-SIM在成像快速移动的细胞对象时减少运动伪影的有效性。
接下来，作者检查了用TOM20-StayGold标记的COS-7细胞外线粒体膜的动力学。通过3D-MP-SIM技术，作者在三维空间中解析了线粒体分裂过程。在丙泊酚刺激下，可以诱导线粒体分裂，作者观察到单个线粒体上的两个内陷位点的动力学变化。一个裂变过程完成，两个囊泡结构完全三维分离；然而，在1秒内另一个重新连接形成一个空心结构（图3e）。此外，作者记录了先前报道的线粒体纳米隧道的裂变过程。通过增强的时空分辨率，作者能够清楚地监测线粒体纳米隧道分裂的进程，包括内陷动力学（图3f）。
为了进一步推动三维快速事件的捕捉极限，作者使用了1 ms曝光时间，这导致每秒11个体积。这种增强的成像速度使ER延伸的快速动力学得以观察。作者注意到内质网小管在轴向迅速穿过一个内质网小管，与另一个内质网小管融合，并最终从较低位置收缩，完成一个内质网（图3h）。作者还观察到两个独立的ER片分布在不同的轴向位置由单个管状内质网连接，随后迅速融合成一个粘性结构（图3i）。
双色3D-MP-SIM用于可视化细胞器相互作用。对于双色3D-SIM成像，必须使用具有不同光谱和照明波长（例如488和560nm）的荧光探针。无论是首先交替使用不同的波长，还是调整轴向平面以首先获取单色体积数据集，都会存在不足。交替使用不同的激发波长会增加获取单个体积所需的时间，可能导致更多的运动伪影。相反，在收集一个通道的数据集后再收集另一个通道的数据集，则会在两种颜色之间引入几秒钟的间隔，这可能阻止两个细胞器之间的动态相互作用被解析。得益于其快速的体积成像能力，3D-MP-SIM可能实现对细胞器相互作用更精确的记录。滤光轮被放置在ISP前方，可以依次切换不同发射波长的滤光片（图1d)，而激发波长则通过声光可调滤波器同步控制。此外，3D-MP-SIM的重建模型不需要将轴向干涉图案的最大条纹调制位置与不同颜色的图像平面对齐，这是传统3D-SIM所必需的。这消除了在相应平面上定位不同相机的需求。
为了展示这一能力，作者在活体COS-7细胞中用TOM20-mStayGold和线粒体探针PKmito Orange标记了线粒体（图4a和补充视频6）。利用双色3D-MP-SIM技术，作者以每秒1.5个体积的速度，在两个通道中有效监测了外膜和内膜的动态变化。这使得作者能够观察到轴向横截面上线粒体嵴的快速动态变化以及外膜（图4b)。此外，作者还观察到一个线粒体nm隧道从其现有结构延伸出另一个纳米隧道，形成一个分支网络，迅速与其他线粒体相互作用后回缩（图4c)。这一过程可能通过连接多个线粒体的互连纳米隧道增强线粒体间的通信。
接下来，作者在活的COS-7细胞中对线粒体和内质网进行了成像。线粒体用TOM20-mStayGold标记，而内质网则使用HaloTag-Sec61β与活细胞兼容的有机染料BD566HTL（参考文献32)进行标记（图4d和补充视频7）。作者观察到管状内质网与环状线粒体接触，管状内质网穿过线粒体内膜的中央孔，该孔逐渐缩小（图4e)。此外，线粒体形成分支网络来执行细胞功能，内质网包裹在线粒体分支连接处（图4f）。此外，作者观察到内质网与线粒体尖端之间的相互作用。随着线粒体的收缩，在内质网与线粒体交界处迅速形成并延伸出一个约500nm长的纳米通道。当线粒体恢复到原来的位置时，这个纳米通道迅速回缩并重新融合在线粒体主体中（图4g)。这一详细的可视化展示了线粒体与内质网在三维空间中的动态互动，强调了它们在维持细胞结构和功能方面的作用。
作者引入了3D-MP-SIM，实现了快速、三维、活细胞超分辨率成像。这一成就依赖于一种定制的图像传感器，用于将来自八个等距物体平面的荧光信号分离到相机的不同区域，并利用光学延迟线实现轴向相位偏移。3D-MP-SIM还集成了基于新物理模型协同进化的重建算法，该模型与传统SIM不同，能够分离重叠的轴向高频谱，并在横向和轴向上重新组装频谱带。全面实验表明，3D-MP-SIM在成像快速动态过程和活细胞相互作用时显著减少了运动伪影，并在横向和轴向维度上保持了增强的分辨率。
尽管3D-MP-SIM可以在样品内部不同深度捕捉厚度为1.55µm的切片，但超过1.55µm的细胞成像会因厚度限制而变得困难。为了克服这一限制，作者可以开发新的ISP单元，能够有效地将荧光光分离成更明显的区域。然而，当图像平面偏离标称平面1µm时，斯特尔比值降至0.8以下，图像质量会下降，对于油浸物镜（数值孔径×60/1.42）。因此，进一步改进ISP或多焦点衍射光栅以校正球面和高阶像差将是这种方法的关键。另一种策略是通过压电台将样品的轴向移动整合到成像过程中，从而实现多个“八平面”单元的顺序成像，并将其重建为体积。实施该策略需要确定一个关键约束条件：轴向移动的距离应是平面间距和轴向模式周期的整数倍（补充注释7）。作者进一步在COS-7细胞的微管和线粒体外膜上展示了该技术的性能。为了尽量减少浸没介质和不同八平面堆叠的水装细胞样品之间的折射率不匹配所引起的球面像差，作者用一个水浸物镜替换了物镜(×60/1.27 NA)。此程序实现了三个图像堆栈的拼接，并有助于重建一个4.26µm厚的样本（扩展数据图4），甚至可能通过增加更多的轴向步长来进一步实现。在水浸物镜条件下，通过增加层间距同时保持斯特尔比值高于0.8，成像深度可以进一步延长，实现八平面成像时厚度达到1.96µm。
轴向相移是通过带压电级的光延迟线实现的。但是，由于系统的轴向放大倍数，即横向放大倍数的平方，产生了延时阶段需要在几十微米的距离上进行机械运动，每次移动大约花费5毫秒。一种替代策略是修改零级光束的相位，这仅需在波长尺度上调整光学路径差。作者使用纯相位硅基液晶高速空间光调制器(HS-SLM)展示了这种方法，该调制器可在1毫秒内移动零级光束的π/2相位。因此，成像速度提高到每秒14个体积。
获取单个3D-MP-SIM帧所需的照明功率大约是传统3D-SIM的八倍，以达到相同的信噪比和重建质量。因此，成像同一体积的整体光剂量与传统3D-SIM相当，其中约5%的光损失归因于ISP。尽管本研究的主要贡献在于光学设计和基于物理模型的算法开发，但作者预期3D-MP-SIM可以通过算法改进进一步降低光剂量。例如，实施利用先前知识的正则化技术，如Hessian矩阵、稀疏反卷积或基于深度学习的方法，可以有效减少曝光时间并提高成像速度。此外，进一步增强高条件数重构算法，可以通过将所需原始数据集减少到7个，有效地将所需原始数据集的限制从30个减少到21个每个方向的相位。通过将这些算法增强功能整合到3D-MP-SIM中，作者可以显著提升其性能，实现更快的成像速度和更长的成像时间。这一进展为进行详细的、全面的三维超分辨率成像和活细胞动力学研究开辟了新的可能性，进一步扩展了3D-MP-SIM在生物研究及其他领域的应用能力。
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来源：凯视迈精密测量
