摘要：近年来，活细胞成像技术的迅猛发展为我们揭示了很多细胞内分子活动的奥秘。尤其是单分子追踪（Single-particle tracking, SPT）技术，它能够精确地捕捉单个分子在细胞内的动态变化，为我们提供了以往无法获取的分子层面的信息。然而，这项技术的广泛
引言
近年来，活细胞成像技术的迅猛发展为我们揭示了很多细胞内分子活动的奥秘。尤其是单分子追踪（Single-particle tracking, SPT）技术，它能够精确地捕捉单个分子在细胞内的动态变化，为我们提供了以往无法获取的分子层面的信息。然而，这项技术的广泛应用面临着一个显著的挑战——荧光染料的光漂白现象。荧光染料在激光照射下逐渐失去荧光能力，这使得长期成像变得困难。特别是在细胞内复杂的分子相互作用研究中，如何克服光漂白成为了亟待解决的问题。
为了应对这一挑战，研究人员们不断探索新型荧光染料，以提高成像的稳定性和持续性。在这一背景下，1月15日Nature Methods的研究报道“Super-photostable organic dye for long-term live-cell single-protein imaging”，介绍了一种新型超光稳定的有机染料，凤凰荧光555（Phoenix Fluor 555，简称PF555）。PF555染料通过光漂白的方式从TSCy5染料中获得，表现出比传统荧光染料长十倍以上的光漂白寿命，且无需额外的抗光漂白添加剂，具有极高的光稳定性和亮度。
这项突破性研究不仅为长时程活细胞单分子成像提供了全新的解决方案，还为细胞内复杂分子动态的长时间观察开辟了新的道路。研究人员利用PF555染料成功地观察到了表皮生长因子受体（EGFR）与包裹有网格蛋白的结构（clathrin-coated structures）之间的长时间相互作用，捕捉到了以往无法通过传统方法发现的分子事件——EGFR内吞作用。这些发现不仅加深了我们对细胞内分子机制的理解，也为未来的生物医学研究提供了更强有力的技术工具。
PF555的超光稳定性、出色的亮度和长期成像能力，使其在细胞生物学、药物研发、疾病研究等领域具有广泛的应用潜力。通过这项技术，研究人员能够以前所未有的精度和持续时间，追踪单个分子在细胞内的动态变化，揭示细胞内复杂的分子交互过程。
揭开细胞内分子动态的神秘面纱
活细胞成像技术为我们提供了前所未有的机会，帮助研究人员实时观察和分析细胞内部的分子动态。然而，这项技术的应用仍然面临一项重大挑战——染料的光漂白问题。荧光染料在持续激光照射下逐渐失去荧光能力，这导致无法进行长时间的活细胞观察。尤其是在单分子追踪（SPT）技术中，染料的光漂白限制了我们对长时间分子行为的追踪与分析，无法揭示更复杂的细胞分子互动过程。
传统的荧光染料在长时间成像中的表现往往无法满足需求。例如，常用的TSCy5染料，在经过持续激光照射后，荧光强度迅速衰减，导致成像过程中分子信息的丧失。这种现象不仅限制了单分子成像的时间，还影响了我们对细胞内动态过程的观察深度。为了克服这一问题，研究人员一直在寻求更稳定的替代方案，以确保长期成像的可靠性和准确性。
这项突破性研究的亮点正是新型染料，凤凰荧光555（PF555）的出现。PF555染料通过对TSCy5的光漂白反应获得，其光漂白寿命比传统染料长十倍以上，且不需要任何抗光漂白的添加剂。根据实验数据，PF555在经过长达314秒的持续成像后仍保持了显著的荧光强度，而传统的Alexa Fluor 555（AF555）在23.6秒后就开始出现明显的光漂白现象。此外，PF555的荧光亮度较AF555高出约4.2倍，具有显著的优势，使其在实际应用中能够提供更长时间、更多细节的单分子追踪数据。
PF555的诞生：从光漂白到超光稳定
光漂白是荧光染料在长时间激光照射下失去荧光的现象，这一过程不仅限制了染料在动态观察中的应用，还影响了成像数据的准确性和可靠性。染料的光漂白速度与其分子结构和光学特性密切相关。传统的荧光染料在连续照射下，分子容易进入激发态和三重态，导致光氧化和光化学反应，进而丧失荧光活性。对于需要长时间成像的实验，光漂白显然成为了一个巨大的障碍。
为了突破这一瓶颈，研究人员通过一种名为“光漂白转化”（photoblueing）的技术，从TSCy5染料中成功衍生出了PF555染料。在这一过程中，TSCy5染料在经过特定波长（642 nm）的激光照射后，逐渐转化为一种光稳定性显著增强的衍生物——PF555。该过程不仅提高了染料的光稳定性，还大幅延长了其使用寿命。根据实验数据，PF555的光漂白寿命达到314秒，是传统TSCy5和其他荧光染料的十倍以上，且没有依赖于抗光漂白添加剂，这一特性在长时间的活细胞成像中显示出巨大优势。
从光学特性来看，PF555具有与传统染料如Alexa Fluor 555（AF555）相似的激发与发射波长，但其光稳定性和亮度却远超后者。PF555的激发波长为555 nm，发射波长为567 nm，其强烈的光吸收能力和较高的量子产率，使其在成像过程中表现出极高的亮度，并能够在长时间的实验中维持稳定的荧光信号。与AF555相比，PF555在经过长时间的照射后仍能保持较高的光强，使得研究人员能够在实验中捕捉到更多细节和更长时间的动态变化。
PF555的超光稳定性及其从AF647衍生的过程（Credit:Nature Methods）
图a：TSCy5的光漂白反应设置图示。在此反应中，100μl的二甲基亚硫酰胺（DMSO）溶液中加入TSCy5染料，并将其置于一个条形石英比色皿中，使用638nm激光直接照射，并持续供应纯氧气。这一过程旨在将TSCy5转化为PF555。
图b：通过高效液相色谱（HPLC）对TSCy5的光漂白反应前后进行比较，图中展示了反应前后的色谱图。不同颜色的线条代表不同的吸收波长（从254nm到630nm），从中可以观察到光漂白后生成的新化合物。此图验证了光漂白反应有效地改变了染料的性质。
图c：进行PF555和TSCy3的光漂白寿命分析，展示了PF555在红色通道（572–624nm）下的荧光图像和平均荧光强度剖面。通过对12个独立测量数据进行平均，生成了指数衰减曲线，以确定其平均光漂白寿命，并标明了标准差。这一分析表明PF555具有显著更长的光漂白寿命。
图d：单分子级别的PF555强度剖面。上面是PF555单分子图像，下面是PF555单分子随时间变化的荧光强度剖面，这为PF555的单分子动态追踪提供了直接证据。
图e：TSCy5（蓝色）、TSCy3（粉色）和PF555（橙色）的^1H核磁共振（NMR）谱图。图中不同颜色的星号标示了化学结构中的相应质子，这些数据帮助进一步验证了PF555的化学结构。
图f：重叠的HMBC（异核多键相关）谱图，展示了TSCy5、TSCy3和PF555的^1H-^13C耦合数据，进一步揭示了PF555与其他染料的分子差异。
图g：PF555的化学结构式，详细描绘了PF555分子的结构特征，包括其不对称的氰类染料结构。
图h：PF555的激发（黄色线）和发射（粉色线）光谱，表明PF555在水中的激发峰值为555nm，发射峰值为567nm，这为其在实际应用中的荧光特性提供了基础。
PF555的超光稳定性：长时间成像的秘密
PF555染料的最大亮点之一是其超长的光漂白寿命，这使其突破了传统荧光染料的局限，为长时间成像提供了前所未有的可能性。传统荧光染料通常在激光照射下迅速失去荧光，导致成像信号逐渐消失，无法进行持久的动态观察。而PF555染料则展现了其卓越的光稳定性，能够在长时间的激光照射下维持稳定的荧光输出。根据实验数据，PF555的光漂白寿命可达到314秒，而常用的AF555染料仅为23.6秒，这一差距显示了PF555在长期成像中的独特优势。
与传统荧光染料不同，PF555的超光稳定性并不依赖于额外的抗光漂白添加剂。通常，为了延长染料的光稳定性，研究人员需要在成像过程中加入氧气清除剂或抗氧化剂，以减少染料的光氧化和光漂白。然而，PF555的创新设计使得它在没有任何抗光漂白添加剂的情况下，依然能够保持极高的光稳定性。这一特性不仅简化了实验步骤，还避免了添加剂可能带来的干扰，确保了成像过程的纯净性和准确性。
活细胞中的实际应用：PF555追踪单分子动态
单分子追踪技术（Single-particle tracking, SPT）作为一种强有力的实验工具，广泛应用于研究细胞内分子的动态行为。与传统的群体成像技术不同，单分子追踪能够实时跟踪单个分子在细胞内的运动轨迹，为研究分子相互作用、细胞内分子运输以及分子定位提供了独特的视角。这项技术尤其在研究膜蛋白、受体及其动态行为时，展现了巨大的应用潜力，帮助研究人员深入理解细胞内复杂的分子事件。
PF555染料的超光稳定性和亮度，使其成为理想的单分子追踪染料。研究人员利用PF555追踪了表皮生长因子受体（EGFR）等单分子在活细胞中的动态变化，突破了传统染料因光漂白导致的时间限制。PF555的光漂白寿命达到314秒，相比其他染料，如AF555（23.6秒），提供了更长的观测时间，使得EGFR的行为能够被细致观察。在研究中，研究人员成功地使用PF555对EGFR进行了长时间追踪，获得了持续的单分子动态数据，揭示了其在细胞膜上的动态行为和内吞过程。
PF555染料特别适用于实时观察EGFR的内吞作用，这是细胞信号传导中至关重要的过程。在传统染料的成像中，由于光漂白，EGFR的内吞过程只能被部分观察到。然而，借助PF555，研究人员能够在1小时的时间内无明显光漂白的情况下，实时捕捉EGFR的完整内吞过程，揭示了分子之间的微小变化和细胞膜的重新塑形。这些发现为我们提供了关于EGFR如何在细胞内传递信号、如何调控细胞行为的全新视角，填补了传统成像方法无法揭示的空白。
PF555的应用不仅展示了它在细胞内分子动态研究中的巨大潜力，还为单分子追踪技术的进一步发展奠定了基础。通过这一技术，研究人员能够在不受光漂白限制的情况下，长期稳定地追踪单分子的运动轨迹，深入理解细胞内复杂的分子互动和生物学过程。
PF555的多重优势：亮度、稳定性与可操作性
PF555染料的最大优势之一在于其亮度和高分辨率成像能力的结合。在成像过程中，荧光染料的亮度直接影响图像的质量与细节捕捉能力。实验数据表明，PF555的亮度比常见的染料，如AF555，具有明显优势。具体来说，PF555的亮度是AF555的4.2倍，能够提供更强的信号，使得即使在低浓度的染料标记下，成像效果也能保持清晰和细腻。这种高亮度的特性使PF555能够在单分子追踪和超分辨率成像等高精度需求的实验中，发挥出色的表现。
与亮度相伴随的是PF555出色的光稳定性。PF555的光稳定性远超传统染料，其光漂白寿命达到314秒，而AF555仅为23.6秒。更为重要的是，PF555在长时间成像过程中不依赖于抗光漂白添加剂，这使得它在实验过程中不仅提供了更长时间的稳定成像，还避免了添加剂可能对细胞或实验结果产生的干扰。与传统染料相比，PF555的光稳定性和持续亮度的优势，使得它成为长期活细胞成像的理想选择。
此外，PF555还具备较强的分子亲和性，使其能够与细胞内目标分子特异性结合。在研究中，PF555成功地标记了多种目标蛋白，如EGFR（表皮生长因子受体），并且与目标蛋白之间的结合稳定性高，这保证了成像的可靠性和准确性。研究表明，PF555在标记蛋白质时表现出极低的非特异性结合，减少了背景噪音，进一步提升了成像质量。
PF555在生命科学中的应用前景
PF555的出现标志着细胞生物学研究的一个新纪元，其在活细胞成像中的出色表现将不仅推动了细胞生物学的发展，也将为研究分子行为、细胞内部动态及分子相互作用提供强大的技术支持。长期以来，细胞内分子运动和动态变化一直是生物学研究中的难题。传统的染料在成像过程中面临光漂白和稳定性差的问题，限制了研究的深入。PF555染料的超光稳定性和高亮度让研究人员能够观察到长期的分子动态过程，揭示了许多以往无法捕捉到的生物学现象。通过PF555，研究人员能够更加精细地描绘细胞内的分子网络，推动细胞生物学特别是分子生物学研究的深入。
PF555在疾病研究和精准医疗中的潜力不可忽视。在疾病的早期诊断、药物靶点的研究以及细胞分子水平的监测中，PF555都能提供独特的技术优势。其出色的光稳定性和高亮度，能够支持长期的动态成像，使得研究人员可以追踪疾病相关分子在细胞内的动态变化，帮助揭示疾病的发病机制。尤其在癌症、神经退行性疾病和感染性疾病等领域，PF555为分子水平的早期诊断和监测提供了可靠的工具，极大推动了精准医疗的进步。通过对单分子动态的精准追踪，研究人员可以精确地了解疾病的发展过程，发现新的治疗靶点，为个性化医疗提供更加精细的分子数据。
此外，PF555的创新性还为其他荧光染料和成像技术的发展提供了启示。其优异的光稳定性和亮度，不仅能推动荧光染料本身的进步，还可能促使新型荧光探针的研发。结合PF555的特性，未来的荧光染料将能够在更广泛的波段内提供光稳定性和高分辨率成像，扩展其应用范围至更复杂的实验场景。此外，PF555的出现也为成像技术的创新提供了思路，例如，结合超分辨率成像、单分子成像等先进技术，PF555有潜力成为一种核心工具，推动生命科学领域的技术革新和研究突破。
参考文献
Kim DH, Triet HM, Lee SH, Jazani S, Jang S, Abedi SAA, Liu X, Seo J, Ha T, Chang YT, Ryu SH. Super-photostable organic dye for long-term live-cell single-protein imaging. Nat Methods. 2025 Jan 15. doi: 10.1038/s41592-024-02584-0. Epub ahead of print. PMID: 39815105.
责编|探索君
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