浙江工业大学团队改造中心代谢和副产物形成途径，在大肠杆菌中实现维生素B5前体合成

摘要：然而，传统化学合成方法因使用高毒物质、污染严重且不环保而存在明显弊端，相比之下，微生物发酵虽被视作颇具潜力的替代途径，但 D-泛解酸产量偏低的状况一直阻碍着其大规模应用于工业生产。

D-泛解酸作为维生素 B₅ 的关键前体，在食品、化妆品和饲料等行业发挥着不可或缺的作用，其市场需求也随之日益增长。

然而，传统化学合成方法因使用高毒物质、污染严重且不环保而存在明显弊端，相比之下，微生物发酵虽被视作颇具潜力的替代途径，但 D-泛解酸产量偏低的状况一直阻碍着其大规模应用于工业生产。

近日，来自浙江工业大学的柳志强研究团队，在 Journal of Agricultural and Food Chemistry 上发表了一篇题为“Metabolically Modifying the Central and Competitive Metabolic Pathways for Enhanced DPantoic Acid Synthesis”的研究，为解决这一难题带来了新的希望。他们选择大肠杆菌作为研究对象，通过代谢工程改造菌株，最终实现了 D-泛解酸生物合成量的明显提高。

值得注意的是，该团队曾在 2024 年 10 月发文，利用大肠杆菌代谢工程增强 D-泛酸（维生素 B5）的产量，实现了 86.03 g/L 的滴度。目前，D-泛酸的微生物合成主要集中在大肠杆菌、巨大芽孢杆菌、谷氨酸棒状杆菌、枯草芽孢杆菌和酿酒酵母。

图｜ D - 泛解酸合成代谢途径（来源：上述论文）

实验初始，该团队便将目光聚焦于大肠杆菌的中心代谢和副产物形成途径。原始大大肠杆菌的菌株 DF1 虽在此前经过基因改造，但 D-泛解酸产量仍不尽人意，在摇瓶和 5 L 发酵罐中分别仅能达到 0.75 g/L 和 8.74 g/L，并且发酵液中存在大量副产物，像乙酸（4.10 g/L）、乳酸（3.89 g/L）和 α-酮戊二酸（4.50 g/L）等的积累问题尤为突出。

为有效提升 D-泛解酸产量，研究人员首先采取措施增强丙酮酸（PYR）前体的供应。他们巧妙地将 PYR 激酶 I 基因 pykA 的启动子替换为强启动子 Ptrc，这一举措使得 D-泛解酸产量成功提高到 0.85 g/L。随后，研究人员对 panB 基因过表达，并引入异源基因 alsS。通过这一系列操作，D-泛解酸产量进一步提升至 1.33 g/L。

在应对副产物问题上，研究团队也实施了一系列针对性策略。他们通过敲除基因 poxB、ldhA，成功减少了乙酸和乳酸的生成。同时，引入重组质粒 99A-BS，使得菌株 DF4/99A-BS 中乙酸和乳酸的积累量显著降低，从而为 D-泛解酸合成保留了更多宝贵的碳源。

图｜不同基因靶点对 D-泛解酸产量和α-酮戊二酸积累的影响。

虽然菌株 DF4/99A-BS 中乙酸和乳酸的积累量已经显著降低，但可能仍存在进一步优化的空间，研究团队利用 CRISPRi 系统展开深入研究，成功筛选出与α-酮戊二酸代谢和运输紧密相关的 6 个关键基因（ppc、mdh、icd、sucA、kgtP 和 dcuA）。在后续研究中进一步发现，对这些基因进行不同方式的调控，如敲除 ppc、kgtP、dcuA 基因，上调 mdh、icd、sucA 基因表达等，能够显著影响 D-泛解酸合成和α-酮戊二酸积累。

例如，敲除 ppc 基因虽在一定程度上降低了 α-酮戊二酸积累，但也对细胞生长和 D-泛解酸产量产生了负面影响；而上调 mdh 基因表达则有力地促进了草酰乙酸合成，进而促使细胞生长和 D-泛解酸产量得以恢复。

最终，经过多轮精心设计的代谢修饰，菌株 DF9/99A-BSB 展现出强大的生产潜力。在摇瓶发酵 48 小时后，其 D-泛解酸产量达到 2.03 g/L，而在 5 L 生物反应器中进行补料分批发酵 76 小时后，产量达到 14.78 g/L，同时副产物乙酸、乳酸和 α-酮戊二酸的积累量大幅降低。