摘要：小麦庞大而复杂的基因组导致其抗病基因克隆进程异常缓慢、繁琐且昂贵。20世纪90年代末至21世纪初的小麦基因克隆项目常耗时十年以上。近年来，基因组辅助克隆工具与快速育种技术的发展显著加速了这一进程。本文提出一种优化的高通量抗病基因克隆工作流程，可在6个月内鉴定致
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小麦庞大而复杂的基因组导致其抗病基因克隆进程异常缓慢、繁琐且昂贵。20世纪90年代末至21世纪初的小麦基因克隆项目常耗时十年以上。近年来，基因组辅助克隆工具与快速育种技术的发展显著加速了这一进程。本文提出一种优化的高通量抗病基因克隆工作流程，可在6个月内鉴定致病基因。作为原理验证，我们克隆了茎锈病抗性基因Sr6 ——该基因在20世纪中叶曾有效遏制北美茎锈病大流行。Sr6 编码一种含CC-BED结构域的核苷酸结合-富亮氨酸重复序列（NLR）免疫受体。本工作流程为系统克隆小麦中所有已描述的抗病基因奠定了基础，将推动抗病基因在育种中的精准部署
问题紧迫性
全球小麦约20%产量因病虫害损失，抗病育种是小麦改良的核心任务。
小麦基因组庞大（~15 Gb）、重复序列多，传统图位克隆耗时长达数年（首个抗病基因克隆比水稻晚8年）。
迄今仅68个抗病基因被克隆（占已命名基因的15%）。
技术瓶颈
现有基因组辅助技术（如染色体分选、靶向富集、转录组测序）虽加速克隆，但仍受限于时间与空间成本。
EMS诱变虽适用于小麦（多倍体耐受6倍于二倍体的突变率），但规模化筛选需大量种植空间。
阶段时长关键操作EMS诱变
3天
高密度播种（15粒/64 cm²），诱导点突变（平均每34 kb一个突变）
M₂群体构建87天
快速育种（22小时光照，21/18℃昼夜温差），单株收穗代表一个M₂家系
突变体筛选52天
接种茎锈菌（Pgt H3），从4000个M₂家系中鉴定98个感病突变体（TA5602:36个；TA5605:62个）
RNA测序与基因鉴定37天
MutIsoSeq分析Iso-Seq（野生型）与RNA-Seq（突变体），锁定候选基因BED-NLR
2. Sr6 基因克隆与验证基因结构：编码含CC-BED结构域的NLR蛋白（TraesFLD2D01G132300.1）。
突变证据：
97个突变体中检出104个点突变（95.2%为G/C→A/T），包括17个无义突变和75个错义突变。
功能验证：
连锁分析：KASP标记与抗性共分离（F₂群体）。
基因沉默（VIGS）：沉默后植株感病性增强。
CRISPR敲除：Fielder品种敲除后丧失抗性。
温度敏感性：20℃高效抗病，26℃抗性丧失（符合 Sr6 特性）。
工作流程突破
时间成本：从传统方法的10年缩短至6个月。
空间成本：仅需3 m²空间完成4000个M₂家系筛选。
普适性：适用于需宿主产生可育分蘖的病原体系。
历史意义
Sr6 作为20世纪中叶北美茎锈病（ISB小种）和21世纪Ug99疫情的关键抗源，其克隆为解析温度敏感抗性机制奠定基础。
推动构建"小麦抗锈基因图谱"，实现抗病基因的理性设计与部署。
技术整合创新
首创 "EMS诱变+快速育种+MutIsoSeq分析"三位一体流程，突破多倍体作物基因克隆效率瓶颈。
高密度种植策略使空间利用率提升10倍（1000个M₂家系仅需0.7 m²）。
方法学突破
MutIsoSeq技术：通过比对野生型全长转录本与突变体RNA-Seq数据，直接锁定致病突变（例：10个突变体均携带同一基因突变）。
无单株追踪策略：混收M₁穗仍能高效鉴定非冗余突变（98个突变体含93个独立突变）。
应用价值
为系统克隆小麦460个已命名抗病基因提供标准化方案。
推动抗病基因专利设计（如编辑 结构域），应对未来锈病大流行威胁。
总结：本研究通过整合基因组学与快速育种技术，建立了小麦抗病基因克隆的"高速通道"，攻克了多倍体作物基因克隆的时空成本难题，为抗病育种提供了革命性工具。
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来源：小象科技每日一讲
