摘要：2025年4月，来自日本京都大学的横川隆司和马成团队在STAR Protocols上发表了题为《Protocol to develop a proximal tubule-on-chip model based on hiPSC-derived kidney

2025年4月，来自日本京都大学的横川隆司和马成团队在STAR Protocols上发表了题为《Protocol to develop a proximal tubule-on-chip model based on hiPSC-derived kidney organoids for functional analysis of renal transporters》的文章。

本文介绍了一种用于构建近端小管芯片模型的方案，该模型利用人诱导多能干细胞 (hiPSC) 衍生的肾脏类器官进行肾脏转运蛋白分析。描述了hiPSC分化为肾脏类器官、近端小管细胞分离以及微流控芯片接种的步骤。

与传统的永生化细胞模型相比，该基于hiPSC的衍生模型增强了转运蛋白的表达和极化，并具有更佳的摄取和流出功能。该方案可作为评估肾脏转运蛋白功能、肾毒性和药物相互作用的平台。

文章介绍

#1

摘要

肾脏转运蛋白通过调节多种内源性和外源性化合物的摄取、分泌及清除过程，保障肾脏正常代谢功能。其中，有机阴离子转运蛋白（OAT1/3）和有机阳离子转运蛋白2（OCT2）是肾近端小管上皮中重要的跨膜转运通道，主要介导药物和代谢产物的跨膜运输。

目前常用的体外模型，如永生化肾近端小管上皮细胞（RPTEC/TERT1）或原代细胞，存在转运蛋白表达水平下降的问题，限制了其模拟体内肾脏生理环境的能力。

本研究基于hiPSC开发了一种近端小管芯片模型，该模型利用从hiPSC来源的肾类器官中分离得到的近端小管细胞，在芯片微环境中实现了OAT1/3和OCT2等关键转运蛋白的高水平表达，从而可用于更准确地评估肾脏转运功能、药物相互作用及潜在肾毒性。

此外，该模型还可整合来源于患者的hiPSC，实现个体化疾病建模与精准医疗研究。该方法结合了类器官构建技术与微流控平台的最新进展，建立了一个在结构与功能上高度模拟人类肾近端小管特性的体外系统，为临床前药物筛选和肾脏研究提供了强有力的研究工具。

#2

研究思路

Methods

第一阶段：准备工作，旨在为芯片实验提供稳定的前期条件

hiPSC来源的类器官培养

芯片模具的制备

培养基和相关试剂的配制

RPTEC/TERT1细胞的培养

第二阶段：芯片系统的组装与功能评估

细胞接种

对关键生理参数的功能检测

实验设计

下图是实验方案的示意图

一. hiPSC衍生肾脏类器官的制备——耗时30天（每天30分钟）

在开始之前，需将hiPSC分化为肾类器官。本实验方案采用了Takasato等人及Tsujimoto等人提出的分化方法，这两种方法已被广泛应用于含肾单位的肾类器官的生成。Takasato方案的分化过程为22天，Tsujimoto方案为27天。在分化开始前，hiPSC需在无饲养层条件下使用Stem Fit AK02N培养基扩增。

在Takasato方案中，分化从第0天起使用含8 μM CHIR99021的APEL2培养基培养hiPSC，诱导形成后原始条带。第5天起，去除CHIR99021，改用含200 ng/mL FGF9和10 mg/mL肝素的培养基，以促进中间中胚层的分化。

第7天，将细胞以每孔30万个的密度接种于U底低黏附96孔板中，并给予8 μM CHIR99021的24小时短暂刺激，以启动肾单位生成。第8天，将细胞团转移至Transwell细胞培养板中，FGF9和肝素于第12天撤除，随后继续培养10天，使类器官进一步成熟。

在Tsujimoto方案中，hiPSC在第11天前被诱导分化为SIX2⁺肾单位祖细胞（NPC）。随后使用Accumax将NPC消化成单细胞，并以每孔20万个的密度接种于M底低黏附96孔板中。24小时后（即第13天），将细胞团转移至Transwell细胞培养板上，进行为期10天的气液界面培养（ALI），以促进肾单位的进一步成熟。

分化完成后，可使用生成的肾类器官进行下游实验，如近端小管细胞的分离与功能分析。用于类器官鉴定的抗体与试剂详见下表。

暂停点：在Takasato方案的第7天或Tsujimoto方案的第11天，分化中的hiPSC可按标准方案冷冻保存，用于后续实验。使用Stem cell banker冷冻液，加入10 μM Y-27632，冻存浓度为800万个细胞/mL。

二. SU-8模具的制备——耗时1天

以构建一个350 μm深的微流道为例。

提示：若需要制备大于350 μm通道深度的模具，建议使用数控铣床或3D打印进行加工。

1. 硅片（Si Wafer）准备

用piranha溶液清洗硅片；

按所需尺寸裁剪硅片；

使用气枪吹除表面灰尘。

2. 脱水烘焙

在200°C加热5分钟，随后转为95°C加热1-2分钟；

将硅片自然冷却至室温（20-25°C），以防硅片开裂。

3. 底漆旋涂

首先设定5秒加速时间进行底漆旋转，然后以3000 rpm旋转30秒（加速2秒）；

将涂层后的硅片放入120°C下烘焙5分钟，随后室温冷却1-2分钟。

4. SU-8光刻胶旋涂

先旋涂250 μm厚度，再追加100 μm厚度，实现总厚度350 μm；

根据目标厚度选择SU-8 2100旋涂参数如下：

制备100 μm厚度（SU-8 2100）

i. 先加速5秒，500 rpm旋转10秒；

ii. 加速1.7秒后，以3000 rpm旋转30秒，加速结束5秒；

制备250 μm厚度（SU-8 2100）

i. 同样先加速5秒，500 rpm旋转10秒

ii. 加速1.7秒后，以1000 rpm旋转30秒，最后加速5秒。

注意：本实验使用SU-8 2100，因此需要连续两次旋涂以达到350 μm。如果使用SU-8 2150，可通过调整转速一次性旋涂所需厚度，详见制造商说明。

5. 预烘焙

在65°C下烘焙7分钟，随后转至95°C烘焙60-120分钟；

自然冷却至室温10分钟。

6. 紫外曝光

使用曝光剂量为500 mJ/cm²的紫外光源进行曝光。

7. 后烘焙

在65°C烘焙5分钟，接着95°C烘焙30分钟；

冷却至室温10分钟。

8. 显影处理

将硅片依次浸入SU-8显影液中：

a. 首次显影：SU-8 Developer中显影30分钟；

b. 二次显影：使用新鲜SU-8 Developer显影2分钟；

c. 清洗：在异丙醇（IPA）中清洗10秒，重复两次。

9. 硬烘焙

在200°C加热30分钟，冷却至室温5分钟。

10. 高度测量

使用DEKTAK表面轮廓仪测量SU-8模具的实际厚度。

11. 硅烷处理（可选）

在培养皿中滴加三氯（1H,1H,2H,2H-全氟辛基）硅烷，抽真空处理30分钟，随后静置至少2小时，以完成模具表面的硅烷化处理。

三. 细胞培养基的配制——耗时30分钟

12. 配制适用的细胞培养基，具体配方详见下表

注意：ATCC配制培养基是市售hTERT永生化RPTEC生长试剂盒，专为RPTEC/TERT1细胞设计。该培养基包含基础培养基（DMEM/F12，ATCC 30-2006）以及ATCC提供的全套补充液A和B。ATCC配制的DMEM:F12完全培养基可在4°C下保存1个月。每次使用前，将100 μL G418（50 mg/mL）加入50 mL培养基中，使其终浓度达到0.1 mg/mL。

注意：REGM肾上皮细胞生长完全培养基可以在4°C下保存1个月。

a. 配制ATCC配方的DMEM:F12培养基，添加0.1 mg/mL G418和1%青霉素-链霉素（即ATCC 配方培养基）；

b. 配制REGM肾上皮细胞生长培养基（REGM），同样添加1%青霉素-链霉素。

注意：不使用REGM补液包中的GA-100，改为添加1%青霉素-链霉素。

c. 配制Y-27632溶液：使用前先对试剂瓶进行离心。向25 mg的Y-27632中加入7.39 mL无菌双蒸水（ddH₂O），配制成10 mM母液。通过反复吹打混匀。分装为每管400 μL，-20 °C保存最长1年。

d. 配制 iMatrix-511芯片包被溶液：向1404 μL PBS中加入96 μL的iMatrix-511 silk，配制用于芯片包被的iMatrix溶液。每次使用前现配，避免储存。

e. 配制1 mg/mL FITC-inulin溶液：称取30 mg FITC-inulin粉末，溶于6 mL HBSS（+）中，配制5 mg/mL 的母液。用0.22 μm滤膜过滤，于4°C保存，可保存1-2周。使用前将其稀释至1 mg/mL的终浓度。

f. 配制1 mM荧光素（fluorescein）溶液：称取33.231 mg荧光素粉末，溶于10 mL DMSO中，配制成10 mM的母液。取其中1 mL用9 mL DMSO稀释，得到1 mM的荧光素储液。用0.22 μm 滤膜过滤，于-20°C保存最长6个月。

g. 配制100 mM丙磺舒（probenecid）溶液：称取557.672 mg丙磺舒粉末，溶于2 mL DMSO 中，配制成100 mM溶液。用0.22 μm滤膜过滤，于-20°C保存最长6个月。

h. 配制HBSS（+）缓冲液（两种pH值：6.0和7.4）：

10 mM HEPES，pH 7.4

称取0.600 g HEPES，溶于5 mL HBSS（+）中，配制成500 mM母液。取其中5 mL加入245 mL HBSS（+）中稀释，混匀得到10 mM HEPES工作液。使用5 N HCl或5 N NaOH将pH调至7.4，用0.22 μm滤膜过滤后于4°C保存。

10 mM MES，pH 6.0

称取0.533 g MES，溶于5 mL HBSS（+）中，配制成500 mM母液。取其中5 mL加入245 mL HBSS（+）中稀释，混匀得到10 mM MES工作液。使用5 N HCl或5 N NaOH将pH调至6.0，用0.22 μm滤膜过滤后于4°C保存。

四. RPTEC/TERT1细胞扩增培养——耗时3-5天

13. RPTEC细胞复苏：

a. 向T-25细胞培养瓶中加入4 mL ATCC配方培养基；

b. 将培养瓶放入37°C培养箱中预热至少15分钟（可在此期间进行以下步骤）；

c. 向一个15 mL离心管中加入8 mL培养基备用；

d. 从液氮罐中取出冻存管；

e. 立即将冻存管快速转移至37°C水浴中快速复温，保持管内少量冰未完全融化，复温时间控制在1分钟以内；

f. 将复温后的细胞转入装有培养基的离心管中；

g. 用1 mL 培养基冲洗冻存管，将残余细胞收集；

h. 将所有细胞混悬液合并于离心管中；

i. 以250 g离心5分钟；

j. 小心倒掉上清，注意不要扰动细胞沉淀；

k. 轻轻拍打离心管底部以松散细胞沉淀；

l. 用 1 mL 培养基重悬细胞，并转移至T-25 培养瓶中继续培养。

14. 将细胞置于37°C、5% CO₂培养箱中培养，维持细胞生长直至达到90%融合度。

以下步骤流程示意图见图1

图1 实验流程

五. 使用磁珠分选（MACS）法从肾类器官中分离LTL⁺细胞——耗时约3小时

以下流程用于从成熟的肾类器官中分选近曲小管细胞（LTL⁺，即莲花四棱豆凝集素阳性细胞），并进行后续扩增培养。

1. 缓冲液准备

a. 分离缓冲液（冰上保存）：

DPBS（-）：49.55 mL

0.5 M EDTA：200 μL

胎牛血清（FBS）：250 μL

b. 组织消化酶混合液：

分离缓冲液：7.05 mL

酶H（Enzyme H）：300 μL

酶R（Enzyme R）：150 μL

酶A（Enzyme A）：37.5 μL

此配方可用于处理7个6孔Transwell插入孔，约对应40个肾类器官，可分装到约9-12个微流控芯片中。

2. 肾类器官消化处理

a. 每孔使用1 mL DPBS（-）分别冲洗Transwell膜上方和下腔，重复两次；

b. 吸尽DPBS后，用宽口1 mL吸头小心将每个类器官转移至1.5 mL离心管中；

c. 向管中加入400 μL分离缓冲液；

d. 置于37 °C、5% CO₂培养箱中孵育15分钟；

e. 用移液器反复吹打25次；

f. 再次孵育15分钟；

g. 再次吹打25次；

h. 将细胞悬液转移至装有14.4 mL分离缓冲液的15 mL离心管中；

i. 以400 g，4 °C离心3分钟；

j. 弃上清，将细胞重悬于2 mL分离缓冲液中，并用血球计数板进行计数；

k. 将细胞通过10 μm细胞筛过滤至50 mL离心管中；

l. 用2 mL分离缓冲液冲洗细胞筛；再次计数；

m. 再次以400 g，4 °C离心3分钟；

n. 弃去3 mL上清，保留约1 mL缓冲液；

o. 将细胞悬液转入新的1.5 mL离心管中；

p. 用小型离心机 400 g，4 °C离心3分钟。

3. 磁珠标记

a. 弃上清，将细胞重悬于396 μL分离缓冲液中；

b. 加入4 μL生物素化LTL抗体（稀释比例1:100），充分混匀，于冰箱中孵育30分钟；

c. 加入800 μL分离缓冲液；

d. 300 g，4 °C离心5分钟；

e. 弃上清，用1 mL分离缓冲液重悬细胞；

f. 重复上一步：300 × g，4 °C离心5分钟；

g. 再次重悬于1 mL分离缓冲液中；

h. 再次300 g，4 °C离心5分钟；

i. 弃上清，重悬于160 μL分离缓冲液中；

j. 加入40 μL抗生物素超纯磁珠（Anti-Biotin Microbeads UltraPure），充分混匀，于冰箱中孵育30分钟；

k. 加入800 μL分离缓冲液；

l. 300 g，4 °C离心5分钟；

m. 弃上清，将细胞重悬于500 μL分离缓冲液中，并进行细胞计数。

4. 磁珠分选

a. 将MS柱安装在MACS分选仪的磁场中，并配套使用30 μm预分离滤器（PreSeparation Filter）；

b. 向滤器中加入500 μL分离缓冲液进行预润洗；

c. 在柱子下方放置一个收集管，用于收集阴性分离部分（未结合磁珠的细胞）；

d. 将细胞悬液加入分选柱中；

e. 使用500 μL分离缓冲液冲洗滤器，重复两次；

f. 将分选柱从磁架上取下，放入另一个收集管中，用于收集磁珠标记的细胞；

g. 向分选柱中加入1 mL分离缓冲液；

h. 立即使用柱塞用力压入柱内，将磁性标记的细胞冲出（确保收集磁珠标记细胞的收集管已经放置好）；

i. 对分选所得的阳性组和阴性组细胞分别计数，并进行比较。

5. LTL⁺细胞接种与传代

a. 在6孔板（Corning CellBIND处理）的每孔中加入1.5 mL REGM培养基，该培养基中补充了10 μM Y-27632；

b. 每孔再加入1.5  μL iMatrix-511 silk（浓度高于0.133 mg/cm²），并轻轻摇动培养板，使培养基混匀；

c. 根据细胞计数结果，每孔接种1×10⁵至1.5×10⁵个细胞；

d. 通过上下和左右轻轻移动培养板混匀细胞，避免旋转培养板以防细胞分布不均；

e. 快速在显微镜下检查细胞分布情况，随后将培养板放入 37 °C、5% CO₂ 培养箱中培养；

f. 保持培养约4天，直至细胞融合度达约70%。

六. PDMS 微流控芯片的制备——耗时1天

本部分详细说明了芯片制备所需的所有关键步骤（见图2）。

图2. PDMS微流控芯片制造过程示意图

6. PDMS 混合液的制备

a. 取约60 g PDMS预聚物置于一次性混合杯中；

b. 按质量比10:1混合Silpot 184基料与固化剂；

c. 混合与脱气：

i. 将含有PDMS 混合物的杯子置于混合器中并进行平衡；

ii. 设定混合器至“Memory 2”程序：搅拌1分钟，脱气2分钟。

7. PDMS 浇注与热固化

a. 将脱气后的PDMS混合物倒入模具，制作两层结构：一层厚板（约5 mm），一层薄板（约1.2 mL，均匀摊开）；

b. 真空脱气：

i. 将含PDMS的模具放入抽真空干燥器中，抽真空约30分钟以去除残留气泡；

ii. 关闭泵前先释放真空；

c. PDMS固化：

i. 将PDMS模具放入烘箱中，在80 °C下烘焙过夜（约12小时）；

ii. 固化后取出模具，放置至室温（20-25 °C）冷却。

8. 切割与剥离 PDMS 板材

a. 用手术刀小心地将 PDMS 板裁剪下来，用刮刀修整边缘以保证平整；

b. 使用穿刺器在厚层PDMS板上打出直径1 mm的进出口孔位。

9. 与PET膜的组装与粘合

a. 玻片旋涂PDMS：

i. 设置旋涂参数为 500 rpm 5秒，随后3000 rpm 60秒；

ii. 用压缩空气清洁玻片，加入少量PDMS后开始旋涂；

b. 芯片组装：

i. 用胶带清洁PDMS表面，去除灰尘；

ii. 将薄PDMS层（旋涂玻片）轻轻压在厚PDMS层上，确保无气泡、充分接触；

c. 膜的放置：

i. 将多孔膜置于两层PDMS之间，使其覆盖通道区域，并准确对齐；

d. 粘合板层：

i. 将薄PDMS层覆盖在厚PDMS层上，并夹住膜，轻轻按压以保证均匀贴合；

ii. 室温静置1小时以完成初步贴合；

e. 最终固化：

i. 将组装好的芯片置于4 °C环境中保存至少2天，以保证完全贴合并去除残余空气；

ii. 再将芯片置于 50 °C 烘箱中加热过夜（约12小时）。

10. 安装进出液口储液池

a. 将硅胶管剪成6×8 mm规格，长度为7 mm；

b. 用硅胶胶水将硅胶管粘贴于芯片的进出口，确保密封牢固无泄漏；

c. 将芯片放入密闭塑料容器中保存，避免接触灰尘或物理污染。

七. 芯片灭菌（用于细胞培养）——耗时30分钟

本部分说明如何使用紫外线灭菌芯片以用于细胞接种：

11. 将组装好的芯片放入塑料盒中，保持盒盖打开；

12. 在无菌操作环境中，使用紫外线（UV）照射芯片30分钟（室温下，20-25 °C）；

13. 灭菌后，将芯片在无菌环境中室温保存，备用。

八. 芯片包被——耗时1天（含孵育时间）

本部分介绍细胞接种前芯片通道的包被方法，可用于LTL⁺细胞或RPTEC/TERT1细胞的接种。

注意：若非对比实验，仅使用RPTEC/TERT1细胞时，可直接向每个通道注入40 μL FNC包被液，室温下静置至少5分钟后进行接种。

14. 向芯片上下通道的入口分别加入200 μL PBS，将芯片置于摇床上摇晃5分钟，摆动角度设置为至少30°C；

15. 向芯片上下通道分别注入40 μL iMatrix-511包被液；

16. 将芯片放入37°C、5% CO₂培养箱中，过夜孵育约12小时；

17. 包被完成的芯片可在培养箱中储存1天，用于接种准备或备用。

九. 细胞接种到芯片中——耗时1小时

本步骤描述将LTL⁺或RPTEC/TERT1细胞接种到预包被芯片中，使用REGM培养基进行芯片内培养。

18. 细胞消化与重悬

a. 吸除培养基（按细胞类型选择T-25瓶或6孔板）；

b. 用5 mL DPBS（-）清洗细胞，吸尽；

c. 加入1 mL 0.5 g/L胰酶/ 0.53 mmol/L EDTA溶液；

d. 于37 °C、5% CO₂培养箱中孵育3-8分钟，待细胞不再贴壁；

e. 显微镜下确认细胞脱落后，加入2 mL DMEM终止胰酶反应（如未完全脱落可适当延长孵育）；

f. 将2 mL细胞悬液转入离心管；

g. 用1 mL DMEM冲洗培养瓶并合并至同一管中；

h. 混匀细胞悬液；

i. 250 g离心5分钟；

j. 离心期间准备细胞计数管；

k. 弃上清，小心避免扰动细胞沉淀；

l. 轻拍离心管底部使细胞松散；

m. 重悬细胞于适量培养基中至目标接种浓度；

n. 进行细胞计数，调整浓度至1.5×10⁵ cells/mL；

o. 若浓度过高则稀释，浓度不足则根据步骤重复处理；

p. 最终再次确认细胞计数。

19. 接种细胞至芯片中

a. 吸出芯片通道中的包被液；

b. 向下通道注入200 μL REGM培养基；

c. 向上通道注入细胞悬液；

d. 静置芯片3分钟，使细胞沉降；

e. 初步孵育约2小时；

f. 向上通道的储液池中加入100 μL REGM；

g. 继续孵育12小时，然后吸出两侧培养液，分别补加200 μL新鲜REGM。

提示：初始2小时孵育后加液时应小心，避免液体直接流入通道扰乱细胞。

20. 芯片换液与培养维护

a. 接种后24小时进行第一次换液；

b. 吸出两侧储液池中的REGM；

c. 分别向储液池注入200 μL REGM；

d. 将芯片置于Infinity Rocker平台，设置1分钟周期，放入37 °C、5% CO₂培养箱中继续培养。

十. 扩散通透性测定——耗时4小时

提示：在吸取溶液或收集培养基时，务必确保通道中仍保留足够液体，以避免引入气泡。荧光化合物对光敏感，应始终避免光照。存储和操作时应使用棕色管或用铝箔包裹容器，以最大限度减少光漂白。

21. 缓冲液准备

a. 配制以下两种缓冲液：

i. 20 mL pH 6.0 HBSS（用于顶部通道，即尿侧）；

ii. 20 mL pH 7.4 HBSS（用于底部通道，即血侧）。

注意：上述体积用于三块芯片的冲洗、预孵育和功能评估。

b. 准备iD3板；

c. 在iD3板中预装100 μL pH 6.0缓冲液；

d. 配制200 μg/mL FITC标记的菊粉溶液：将1 mg FITC-菊粉溶于5 mL pH 7.4缓冲液中；

e. 配制100 μg/mL菊粉溶液：将2 mL的200 μg/mL溶液与2 mL pH 7.4缓冲液混合；

f. 配制10 μg/mL菊粉溶液：将20 mL 100 μg/mL菊粉与180 mL pH 7.4缓冲液混合制得；

g. 按以下比例配制校准溶液，使用pH 6.0缓冲液稀释：0 μg/mL：100 μL缓冲液 + 100 μL缓冲液；0.2 μg/mL：4 μL 10 μg/mL溶液 + 96 μL缓冲液 + 100 μL缓冲液；0.5 μg/mL：10 μL 10 μg/mL溶液+ 90 μL缓冲液 + 100 μL缓冲液；1.0 μg/mL：20 μL 10 μg/mL溶液 + 80 μL缓冲液 + 100 μL缓冲液；2.0 μg/mL：40 μL 10 μg/mL溶液 + 60 μL缓冲液 + 100 μL缓冲液；3.0 μg/mL：60 μL 10 μg/mL溶液 + 40 μL缓冲液 + 100 μL缓冲液；10.0 μg/mL：20 μL 100 μg/mL溶液 + 80 μL缓冲液 + 100 μL缓冲液；25.0 μg/mL：50 μL 100 μg/mL溶液 + 50 μL缓冲液 + 100 μL缓冲液。

注意：稀释操作需严格精准。

h. 校准曲线验证：

i. 使用iD3板阅读器，以激发波长488 nm和发射波长530 nm测定荧光强度；

ii. 绘制浓度0至25.0 μg/mL的校准曲线，确保其荧光强度与浓度呈线性关系。

22. 去除培养基与通道冲洗

a. 使用吸管移除芯片内的培养基，在顶部和底部通道中加入200 μL缓冲液，冲洗两次后吸去缓冲液；

b. 预孵育：

i. 向上下通道各加200 μL缓冲液，37℃孵育30分钟；

ii. 孵育后，从顶部通道取出100 μL并加入100 μL 200 μg/mL菊粉溶液，使顶部通道最终浓度为100 μg/mL。

注意：顶部通道用pH 6.0缓冲液，底部通道用pH 7.4缓冲液。加完后轻轻倾斜芯片以均匀分布溶液。

c. 将芯片置于0.5次/分钟的摇床上，按时间点（30、60、90、120、180分钟）收集底部通道100 μL样品，同时用pH 7.4缓冲液补充，并倾斜芯片混匀。

注意：吸取样品时，两次从一侧吸入并从另一侧排出以混匀溶液。

23. 荧光强度测定

a. 确保iD3与计算机连接（左上角应显示绿色勾）；

b. 设置如下：

设置：点击橙色齿轮图标；

荧光模式：选择“终点”；

波长：激发488 nm，发射530 nm；

板类型：96孔黑色透明底板，取消“带盖”选项；

读取区域：选择所需区域；

PMT和光学：保持默认增益，必要时调节“读取高度”（默认0.5）；

摇动：推荐启用以获得更好结果；

更多设置：默认即可；

c. 打开仪器并插入iD3板进行读取；

d. 首先测量空白缓冲液的荧光强度以建立零点；

e. 测定五种标准浓度溶液的荧光强度；

f. 测量从顶部通道采集的100 μL样本的荧光强度以评估渗漏速率（见图3）。

图3. 将100  μg/mL的FITC标记菊粉（3000 Da

十一. 芯片的免疫荧光染色——耗时4-6小时

本步骤描述将LTL⁺或RPTEC/TERT1细胞接种到预包被芯片中，使用REGM培养基进行芯片内培养。

24. 固定与通透处理

a. 用吸头吸除芯片内的培养基；

b. 用200 μL DPBS(-) 清洗芯片3次，以去除残留培养液；

c. 在顶部通道加入200 μL 4% 多聚甲醛（PFA，溶于DPBS(-)中）固定细胞，室温（20-25 °C）孵育15分钟；

d. 去除PFA后，用DPBS(-) 冲洗通道3次，去除残留固定液；

e. 在顶部通道加入200 μL 0.1% Triton X-100（溶于DPBS(-)）进行细胞通透处理，室温孵育10分钟；

f. 再用DPBS(-) 清洗芯片3次。

25. 阻断与一抗孵育

a. 向上下通道加入200 μL封闭液（10% 驴血清于DPBS中），室温摇床孵育1小时；

b. 按照表1用新鲜封闭液稀释一抗，制备一抗工作液；

c. 去除封闭液后，在顶部通道加入 200 μL一抗工作液；

d. 将芯片放入湿润室中，于4 °C过夜孵育（约12小时）。

注意：为避免蒸发，可将芯片放入密封的透明聚苯乙烯盒中。尽管每个通道仅需约40 μL 抗体液，建议加入200 μL以补偿蒸发损失。

26. 二抗及核染色

a. 用DPBS(-) 清洗通道5次，每次孵育5分钟；

b. 按 1:400 稀释荧光标记二抗于DPBS(-)中，制备二抗工作液；

c. 向顶部通道加入200 μL二抗溶液，室温避光摇床孵育1小时；

d. 用DPBS(-) 再清洗通道3次，每次孵育5分钟；

e. 向顶部通道加入200 μL DAPI（1 μg/mL）染色核，室温孵育10分钟；

f. 再次用DPBS(-) 清洗一次；

g. 小心分离芯片上下层，使用镊子剥离含细胞的膜；

h. 将膜置于载玻片上，滴加抗荧光淬灭封片剂；

i. 加盖玻片并用透明指甲油封边；

j. 待指甲油完全干燥后固定盖玻片；

k. 将制备好的载玻片储存在4 °C、避光湿润环境中，待镜检分析。

十二. 荧光素摄取与转运实验——耗时4小时

27. 缓冲液准备

a. 配制以下四种缓冲液：

i. 含100 μM Probenecid的缓冲液：

10 mL pH 6.0 HBSS + 10 μL 100 mM Probenecid

10 mL pH 7.4 HBSS + 10 μL 100 mM Probenecid

ii. 不含Probenecid的缓冲液：

10 mL pH 6.0 HBSS + 10 mL DMSO

10 mL pH 7.4 HBSS + 10 mL DMSO

注意：上述体积足以满足三块芯片的冲洗、预孵育与功能实验需求。

b. 配制 4 μM 荧光素溶液：将 8 mL 荧光素加入 2 mL pH 7.4 缓冲液中（分别含/不含 Probenecid）；

c. 配制Hoechst溶液：2 mL Hoechs加入2 mL pH 6.0 缓冲液中（分别含/不含 Probenecid），最终浓度为 10 ng/mL；

d. 准备 20 mL pH 7.4 HBSS用于底部通道（血侧）。

28. 实验前准备与处理

a. 用吸管移除芯片内培养基，向上下通道加入 200 μL 准备好的缓冲液，冲洗两次后吸尽。

注意：顶部通道使用不含Probenecid的 pH 6.0 HBSS，底部通道使用不含Probenecid的 pH 7.4 HBSS。

b. 预孵育：

i. 向底部通道加入 200 μL 缓冲液；

ii. 向顶部通道加入 200 μL Hoechst 溶液，孵育 30 分钟；

实验组：顶部通道使用不含 Probenecid 的 Hoechst 溶液，底部通道为不含 Probenecid 的 pH 7.4 HBSS；

抑制组：两侧均使用含 Probenecid 的对应溶液。

c. 预孵育后，吸除顶部通道液体并清洗一次，从底部通道取样100 μL；

实验组顶部通道用不含Probenecid的pH 6.0 HBSS；

抑制组使用含Probenecid的对应缓冲液。

d. 将芯片放置于共聚焦显微镜的恒温载台上；

e. 向底部通道加入100 μL 4 μM荧光素溶液，使最终浓度为2 μM。加完后轻轻倾斜芯片使其均匀分布；

f. 同步开始共聚焦显微镜拍摄，滤镜设定为：FITC：Ex/Em = 490/525 nm（cutoff 515 nm），DAPI 通道：352/461 nm；从距顶部通道 Hoechst 染色细胞区域约 50 μm处开始成像，延申至膜（图4）；每 2 分钟采集一次图像，共采集30分钟。

提示：所有步骤中，抑制组使用包含Probenecid的缓冲液。

图4. 共聚焦图像说明荧光素的吸收，显示带有Hoechst共染色的横截面荧光图像，比例尺：300 μm。

29. 荧光强度测定

成像30分钟后，从顶部通道收集样本，按照“扩散通透性测定”部分的方法测定其荧光强度。

十三. 跨上皮运输与抑制实验——耗时6小时

提示：在吸取溶液或收集培养基时，必须确保通道中保留足够的液体，以避免引入气泡。以下以阿德福韦为底物，详细说明实验步骤。

30. 缓冲液准备

a. 配制以下四种缓冲液：

含 100 μM Probenecid 的缓冲液：

10 mL pH 6.0 HBSS + 10 mL 100 μM Probenecid

10 mL pH 7.4 HBSS + 10 mL 100 μM Probenecid

不含 Probenecid 的缓冲液：

10 mL pH 6.0 HBSS + 10 mL DMSO

10 mL pH 7.4 HBSS + 10 mL DMSO

注意：上述体积足以满足三块芯片的冲洗、预孵育和功能评估所需。

b. 配制 20 μM 阿德福韦溶液：将 20 μL 2 mM 阿德福韦储备液加入 1980 μL pH 7.4 缓冲液（分别含或不含 Probenecid）中，配制成20 μM工作液。

31. 去除培养基与冲洗

a. 使用吸头移除芯片内的培养基，向顶部和底部通道分别加入 200 μL 缓冲液冲洗两次，然后吸尽缓冲液。

注意：顶部通道用pH 6.0不含Probenecid的HBSS，底部通道用pH 7.4不含Probenecid 的 HBSS。

b. 预孵育：向上下通道各加 200 μL 缓冲液，孵育 30 分钟。

实验组：顶部通道用不含 Probenecid 的 pH 6.0 HBSS，底部通道用不含 Probenecid 的 pH 7.4 HBSS；

抑制组：上下通道均使用含100 μM Probenecid 的缓冲液。

c. 预孵育后，从底部通道取出100 μL，加入100 μL 20 μM阿德福韦溶液，使底部通道中最终浓度为 10 μM。

注意：加入阿德福韦后，轻轻倾斜芯片数次，使药物分布均匀。抑制组的所有步骤均使用含 Probenecid 的缓冲液。

32. 时间点取样

在每个时间点（30、60、90、120 和 180 分钟），从顶部通道取出 100 μL，并用 pH 6.0 缓冲液替代。倾斜芯片以确保溶液均匀分布。

注意：取样时，需从一侧吸入并从另一侧排出两次，以混匀样品。

33. LC/MS 测定

a. 从上清液中收集样本后，立即与等体积的乙腈混合；

b. 将混合溶液以 15000 g 离心5分钟；c. 使用 Cosmonice 滤器（Nacalai Tesque）过滤样品，并通过LC/MS测定阿德福韦浓度；

d. LC/MS分析使用岛津 LCMS-8060NX 仪器完成，具体方法见表 2 和表 3。每个多反应监测（MRM）通道的驻留时间设为 100 ms。

十四. 肾毒性检测——耗时2-3小时

34. 时间点取样

a. 用新鲜REGM培养基彻底冲洗所有储液槽和芯片通道，以去除残留培养基；

b. 向芯片底部通道加入 200 μL含顺铂（100 μM）或马兜铃酸（50 μM）的REGM；

c. 将芯片置于37 °C恒温培养箱中，维持标准培养条件；

d. 培养24小时或48小时后，从上下通道分别收集培养基至1.5 mL EP管中；

e. 以 5000 g 离心5分钟，去除细胞碎片；f. 将上清液转移至新的离心管中，存放于-20 °C，备用于后续的LDH检测。

35. 西咪替丁抑制实验

a. 用新鲜REGM培养基彻底冲洗所有储液槽和芯片通道，以去除残留物；

b. 向芯片上下通道加入 200 μL 含西咪替丁（10 μM）的REGM进行预处理；

c. 将芯片置于37 °C 孵育箱中孵育30分钟；

d. 吸除底部通道的培养基；

e. 用含顺铂（100 μM）与西咪替丁（10 μM）的REGM替换底部通道的培养基；

f. 按照设定的暴露时间（24小时或48小时）进行孵育；

g. 按照步骤 d-f（即第34步）收集并处理培养基样本；

h. 设置未处理对照组，即芯片维持在无药物暴露的条件下培养。

36. LDH 检测

a. 将冷冻保存的培养基样本于室温（20-25 °C）解冻，仅使用第一次解冻的样品；

b. 轻轻混匀每个样本后再转移；

c. 吸取100 μL样本加入透明、平底的96孔板中；

d. 向每孔中加入100 μL工作液启动反应；

e. 室温避光孵育 30分钟；

f. 孵育后向每孔加入50 μL终止液；

g. 检查是否有气泡，如有使用注射器去除，以确保吸光度读数准确；

h. 使用酶标仪在490 nm波长下读取吸光度值。

注意：LDH检测使用Cytotoxicity LDH Assay Kit-WST。如使用其他LDH检测试剂盒，须遵循对应厂商的标准说明书操作。

预期结果

本方案能够构建一个由hiPSC来源的肾小管上皮细胞组成的肾近端小管芯片模型（PToC）。该芯片内形成极化的近端肾小管上皮单层细胞，成功重现了肾脏生理的关键特征。细胞接种后，LTL+细胞或RPTEC/TERT1细胞在微流控通道内形成融合的单层细胞结构，排列紧密有序，与体内近端小管结构高度相似。

免疫荧光染色证实了关键肾转运蛋白（如OAT1、OAT3和OCT2）的表达及定位，表明该芯片具备功能性屏障和转运能力。通过FITC-inulin的扩散通透性测试可评估屏障完整性和功能性，当通道间漏出极少时说明屏障功能良好（图3）。

此外，该芯片还可通过荧光素摄取和运输实验实现肾转运活性的实时分析，展现其有效的转运功能，并可应用于药物相互作用研究。此PToC模型提供了一个可靠的体外平台，可用于研究肾毒性、药物转运及个体化医疗，在模拟人体肾脏生理方面具有显著优势。

局限性

该PToC模型的一项局限性在于依赖外部培养基储液槽并通过手动换液，这可能引入流速波动，限制了其实现全自动操作的能力。未来的改进方向可包括集成自动流体控制系统或微型泵，以维持稳定的连续流动，从而进一步标准化细胞培养条件。

此外，尽管该芯片成功模拟了近端肾小管的部分生理功能，但可能仍难以完全再现体内复杂的细胞-分子相互作用及其对系统性信号的动态响应。因此，尽管本模型适用于研究特定肾功能，但若要模拟更复杂的肾脏微环境或构建多细胞类型参与的模型，仍需进一步优化。

最后，虽然该芯片可用于评估肾转运功能与肾毒性，但由于芯片设计限制，实时成像及动态监测细胞过程的能力较弱。为提高实时功能分析的能力，未来版本可考虑引入透明通道设计，以兼容活细胞动态成像技术。

可能遇到的问题

问题1：芯片膜面出现弯曲，导致细胞无法附着并形成融合单层（图5B）。

图5.问题1的芯片中膜的照片 (A) 弯曲膜的图像。(B) 正常膜的图像。

潜在的解决方案：

制作过程：放置膜片后避免用手直接接触芯片。建议使用镊子将芯片轻放于玻璃或塑料板上，并在后续步骤中移动底板而非直接操作芯片。固化时使用50°C烘烤过夜（约12小时），避免使用更高温度以防膜材过度变形。

粘合与操作：粘合及后续操作过程中应避免用手按压芯片，以免进一步加剧膜面弯曲或翘曲。

灭菌：禁止使用乙醇或干乙醇高温灭菌，这种方式容易导致膜变形。应采用其他可维持芯片结构完整性的灭菌方法。

问题2：PDMS层中出现气泡，妨碍正确粘合或干扰观察。

潜在的解决方案：

建议进行三轮脱气处理，以最大限度减少气泡形成。将PDMS基础胶与固化剂混合后，首先在真空腔中彻底脱气，去除混合过程中引入的空气。将PDMS混合液注入模具后，再次进行脱气，以清除倒胶过程中产生的气泡。在PDMS层粘合后，再进行一次脱气，以确保界面间不残留气泡，避免影响粘附强度或显微成像质量。

问题3：注入细胞悬液时，通道中引入空气气泡。

潜在的解决方案：

注射前准备：剪短移液器吸头，使其与芯片入口紧密贴合，防止空气泄漏。可在上层通道接种细胞前，先向下层通道加入培养液，以稳定系统、减少气泡生成。

注射操作：缓慢、均匀地注入细胞悬液，以尽量减少空气的带入。

气泡去除：如通道中已有气泡，可用新鲜培养液轻柔冲洗通道，以移除气泡。若细胞悬液量充足，无需回收通道内细胞，直接吸走培养液并用新液体冲洗即可；若细胞悬液有限，先回收已接种的细胞，再冲洗通道，去除气泡后可重新接种原细胞或新配制的细胞悬液。

问题4：细胞在上层通道PDMS表面或单层细胞上生长，导致形成多层细胞结构。

潜在的解决方案：

接种后次日，使用新鲜培养液轻柔冲洗通道，去除死细胞及附着于PDMS表面的细胞。注意避免直接用移液器冲刷通道，以防冲走已附着的细胞层。可向芯片两侧的储液槽中加入新鲜培养液，然后倾斜芯片，使培养液通过重力缓慢流经通道。重复多次该过程，直至将附着于PDMS表面的细胞被冲洗干净。

问题5：细胞未附着于膜表面，接种后次日细胞密度明显下降。

潜在的解决方案：

接种操作：缓慢、轻柔地注入细胞悬液，避免液体流速过快将大量细胞冲至通道末端。

接种后处理：接种完成后，至少静置芯片3分钟，避免立即进行显微观察或放入培养箱等操作引起振动，防止细胞偏向通道入口或出口聚集。

培养液更换：细胞接种后不应立即更换培养液。建议于接种5小时后，分别向上层通道两侧储液槽中缓慢加入100 μL培养液，提供稳定环境促进细胞附着。完整更换培养液应延迟至接种后12小时进行，以确保细胞牢固附着于膜表面。

问题6：在菊粉渗漏测试中，作为对照使用的裸膜芯片有时会显示异常低的渗漏结果。

潜在的解决方案：

对于裸膜芯片（对照组），在测试前应使用培养基预孵育过夜（约12小时）。此步骤有助于使培养基充分渗透膜结构，减少裸膜与接种细胞的膜之间的表面张力差异，从而提高测试结果的一致性和可靠性。

参考文献

Ma C, Banan Sadeghian R, Negoro R, et al. Protocol to develop a proximal tubule-on-chip model based on hiPSC-derived kidney organoids for functional analysis of renal transporters. STAR Protoc. Published online April 22, 2025. doi:10.1016/j.xpro.2025.103777.

来源：培养盒守护者