摘要：鉴于需要包括多个个体和潜在人群队列的实验设计，以高分辨率和机械精度剖析人类神经生物学需要在可扩展性方面实现重大飞跃。意大利米兰大学Giuseppe Testa团队已经开发并基准化了互补策略，以通过在对类器官进行单细胞RNA测序（scRNA-seq）文库制备之前
鉴于需要包括多个个体和潜在人群队列的实验设计，以高分辨率和机械精度剖析人类神经生物学需要在可扩展性方面实现重大飞跃。意大利米兰大学Giuseppe Testa团队已经开发并基准化了互补策略，以通过在对类器官进行单细胞RNA测序（scRNA-seq）文库制备之前，汇集来自不同个体的多能干细胞（PSC），进而实现大脑类器官的多重化。此外，他们还开发了一种新的计算方法SCanSNP，并提出了对细胞身份进行反卷积的共识呼吁，克服了当前双峰和低质量细胞鉴定的关键问题。这套多重化实验和计算方法为脑部疾病和神经多样性建模提供了高度可扩展的资源。
文章介绍
题目：Multiplexing cortical brain organoids for the longitudinal dissection of developmental traits at single-cell resolution（多重化皮质脑类器官可用于在单细胞分辨率下纵向解剖发育特征）
杂志：Nature Methods
影响因子：36.1
发表时间：2024年12月
#1
研究背景
Background
人类神经多样性的多基因基础，在其生理和病理的展开方面，需要新的地图来追踪人类遗传背景真实性的展开，从而使其可操作。发育的随机性和环境诱因增加了这种复杂性，并且可测量的范围越来越广，有望使基因-环境相互作用最终在有意义的尺度上变得易于处理。
脑类器官和单细胞多组学技术在人类神经发育的机械解剖方面取得了重大进展，从神经精神疾病的遗传和环境原因的研究中获得了变革性的见解。但是，以单细胞分辨率对整个队列的脑类器官进行表征仍然是一个挑战，但如果要捕捉个体基因组和发育轨迹如何在神经多样性范围内塑造脆弱性和弹性的变异性，这显然是必需的。通过单细胞组学扩大人脑类器官建模和分子分析将使我们能够了解神经发育障碍的分子原因如何触发生理学偏差，与群体水平单细胞研究的扩展集一致。然而，由于成本和工作量高以及所需复杂实验设计固有的批次间差异性，这仍然是一个实验和分析挑战。
单细胞多重策略方面已经取得了进展，包括基于样品条形码的方法和利用天然遗传变体检测的方法。这些方法确实被证明有助于群体遗传学和疾病建模研究。然而，多重化尚未系统地应用于类器官，考虑到细胞类型的高度异质组合的长期纵向展开，这一挑战与大脑特别相关，并且该领域仍然缺乏能够建立将多重化策略应用于复杂三维实验系统的实验和计算可行性的研究。
本研究实施并基准化了互补策略，以在体外对多重人脑类器官发生，在类器官生成期间或在scRNA-seq文库制备之前汇集来自不同个体的PSC，将其称为镶嵌模型。本研究还开发了一种计算机反卷积方法（SCanSNP），将其与现有的反卷积工具进行基准测试，从而产生了一个共识管道，用于在不同质量的数据集上进行稳健的基因型识别。最后，通过深入重建神经发育轨迹来评估这两种多重化范式，提供了它们适用于将遗传变异与神经发育轨迹表型联系起来的原则证明，并对系统的可扩展性进行了建模，分析了不同的多重化组合，并增加了线路数量。这提供了一个资源，用于扩大大脑类器官建模，以应对人类神经多样性的挑战。
#2
研究方法
Methods
通过开发和验证两种多路复用策略，研究了脑类器官在人类神经发育轨迹解析中的应用。研究首先使用嵌合模型，将不同供体的PSC系在类器官生成过程中混合；其次采用下游多路复用在scRNA-seq前混合来自单独PSC生成的类器官的细胞。为了优化细胞的解卷和双胞体检测，研究开发了新算法SCanSNP，并与现有算法（如demuxlet、souporcell和Vireo）进行对比验证。此外，通过单细胞转录组分析和不同时间点的发育轨迹重构，深入探讨了不同基因型在神经发育过程中的动态特性，并通过实验模拟和Census-seq评估系统的扩展性，提出了基于嵌合类器官的高通量研究框架。
#3
研究结果
Results
1、多重CBO（mCBO）的单细胞分析
为了测试在延长的发育时间过程中多重化脑类器官建模的可行性，研究人员比较了两种在缩放、标准化潜力和实验挑战方面具有独特特征的方法：
（1）在类器官产生之前，合并来自多个供体的PSC系并在分化的50、100和300天时通过scRNA-seq纵向分析所得的mCBO，遵循先前实验中使用和基准化的相同方案；
（2）从PSC系单独产生CBO并仅在单细胞液滴包封之前合并它们，同样在分化的50、100和300天进行分析，在类器官解离后将每条系等量的细胞合并用于单细胞库制备。（图1）
图1 多重化范例和实验设计的示意图
2、mCBO的实验评估
首先通过免疫荧光证实了mCBO表达神经发育的典型标志物。接下来，为了估计在整个开发过程中mCBO内不同PSC系存在的稳定性，流式细胞术的细胞周期分析显示跨细胞系的相似增殖趋势，预期增殖沿着分化降低，并且不同细胞系的增殖速率随时间点无实质性变化。（图2）
图2 mCBO的实验评估
3、多路分解算法的基准测试
研究人员开发了一种新的方法，SCanSNP，通过：（1）将分类挑战分为两个步骤，一个用于身份分配，一个用于双联体检测；（2）测量每个液滴的遗传纯度以识别低质量液滴并将其与真实的双联体分离来克服观察到的局限性。最后，设置了一个共识调用框架以巩固去卷积的准确性，考虑到每个算法的优点和缺点，包括用于双联体和低质量细胞检测的基于非遗传的工具，将其结果合并为一个组合输出。
研究还发现，如果与理论上预期的Expected、SCanSNP和Consensus相比，Demuxlet，Souporcell和Vireo都倾向于高估双峰。通过SCanSNP和共有识别鉴定的双联体是唯一的分子标识符的平均对数计数分布如预期的那样高于单联体的双联体。如图3所示，在模拟数据集中，所有解复用算法在平衡情况下表现更好，并且SCanSNP在平衡和不平衡设置中都是最准确的。（图3）
图3 SCanSNP和共识呼叫概述和基准
4、神经发育细胞类型分析
接着分析了四个PSC系在50天、100天和250-300天的时间点和两种多重模式的单细胞转录组数据集，力导向图可视化整合的数据集。通过分析相关标志物的表达分布，定义驱动每个聚类的基因特征，并将细胞投影到参考单细胞人胎脑数据集上，系统地注释了每个细胞群的身份。定义了放射状胶质细胞、迁移神经元、兴奋性神经元、抑制性神经元和Cajal-Retzius样细胞等主要细胞群体。此外，Milo证实了镶嵌类器官和下游复用类器官跨时间点的显著差异。（图4）
图4 样品复用允许鉴定阶段特异性神经发育细胞群
5、基因变异与发育轨迹的关联
通过扩散伪时间（dpt）分析来自不同时间点和多重化模式的单细胞如何沿着那些神经发育轨迹分布。对于兴奋性谱系，轨迹分析使我们能够识别两条时间上不同的神经发生路径，它们最终协调成兴奋性神经元簇，其中EOMES是差异的关键驱动因素之一。特别是迁移神经元的轨迹，显示了细胞沿着伪时间分布的更大和最可重复的基因型多样性。
沿着这条轨迹，发现了两个亚组（每个亚组两个个体）之间的差异，这代表了迁移神经元分化轨迹的替代物。进一步区分这两个亚群的基因变异，在通过质量筛选的24，987个编码变异中有1，035个在两组之间呈现出不同的等位基因配置，而且遗传变异中的11个之前已被鉴定为iPSC衍生神经元群体规模scRNA-seq图谱中的单细胞表达数量性状基因（eQTL）。其中两个变异是SRCIN 1顺式作用eQTL，SRCIN 1是鉴定出的一个轨迹特异性高变异基因（HVG）。（图5）
图5 多重CBO概括了关键的神经发育轨迹
6、mCBO的可扩展性
同样地，通过Census-seq在五个不同的时间点分析每个镶嵌组合，以测量mCBO分化过程中的PSC系平衡。当产生mCBO时，从平衡的细胞系混合物开始，细胞系平衡在分化的早期阶段已经改变，导致对于一些细胞系，在稍后的时间点细胞数量非常低。
对于每个PSC品系在镶嵌体中的贡献，它在相同混合物的重复中是可再现的，并且它反映了不同混合物中的品系特异性行为。因此，又探索了可扩展性问题的替代解决方案，将纵向Census-seq与mCBOs成像数据整合以模拟mCBO克隆动态，从而确定镶嵌模型的可行性上限，作为其暴露单细胞内表型的灵敏度的函数。
通过组合如通过成像测量的镶嵌类器官生长速率和如通过Census-seq测量的特定PSC系的百分比来推导每个PSC系的“镶嵌生长速率”。然后，计算mCBO中来自每个PSC系的细胞的推导数量的经验概率分布，并将其用作具有两个初始参数的Monte Carlo模拟的基础，结果发现，有效恢复的细胞系的数量随着混合的细胞系数量的增加而增加（尽管相对代表性降低）。考虑到通过不同数量的PSC系以及通过PSC系的不同组合产生的mCBO之间的相似克隆动力学，系统的可扩展性目前仅受在产生mCBO时可以准确计数和多重化的系的数量限制。因此，可以计算不同的多重方法对进行大规模疾病建模研究所需的实验时间表的影响。
由于不同轮分化实验的并行处理提供了根本性的加速，mCBO从这项分析中成为一种使能方法，例如，将1000条线的分析从10年压缩到3年，从而标记出当前资金中的差异。大多数学术机构的项目管理生态系统，在很大程度上不切实际的设置和常规可行的设计之间。（图6）
图6 mCBO的可扩展性
结论
本研究提出并验证了两条多重化策略，用于在单细胞分辨率下系统性地解析人类神经发育过程。通过嵌合模型和下游多路复用，成功地将来自不同供体的多能干细胞混合生成皮层脑类器官（CBO）；本研究还开发了SCanSNP算法，解决了细胞身份解卷和双胞体检测中的挑战。这套多重化实验和计算方法为脑部疾病和神经多样性建模提供了高度可扩展的资源。研究还强调当生物学问题需要在各个品系之间保持严格平衡时，选择下游多重策略，而镶嵌模型非常适合无偏见的大规模研究，还能缩短时间。
参考文献：
Caporale N, Castaldi D, Rigoli MT, Cheroni C, Valenti A, Stucchi S, Lessi M, Bulgheresi D, Trattaro S, Pezzali M, Vitriolo A, Lopez-Tobon A, Bonfanti M, Ricca D, Schmid KT, Heinig M, Theis FJ, Villa CE, Testa G. Multiplexing cortical brain organoids for the longitudinal dissection of developmental traits at single-cell resolution. Nat Methods. 2024 Dec 9. doi: 10.1038/s41592-024-02555-5. Epub ahead of print. PMID: 39653820.
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来源：培养盒守护者