摘要：研究背景尽管CRISPR/Cas9技术已广泛应用于基因编辑领域，实现了高效的靶向基因敲除和单碱基编辑，但大片段基因精准定点整合仍然是技术难点。当前的基因递送技术面临诸多挑战：病毒载体存在多重局限性, 包括其具有的免疫原性容易引发免疫反应；病毒制备工艺复杂且成本
研究背景 尽管CRISPR/Cas9技术已广泛应用于基因编辑领域，实现了高效的靶向基因敲除和单碱基编辑，但大片段基因精准定点整合仍然是技术难点。当前的基因递送技术面临诸多挑战：病毒载体存在多重局限性, 包括其具有的免疫原性容易引发免疫反应；病毒制备工艺复杂且成本高；载荷容量受限；以及慢病毒和腺相关病毒的随机基因片段整合可能带来潜在的安全风险。与此同时，非病毒载体也同样面临着问题，如双链DNA（dsDNA）存在效率低及毒性高的缺陷，以及线性单链DNA（lssDNA）存在量产困难等挑战。 这些技术瓶颈为免疫细胞（如CAR-T细胞）的工程化改造和癌症免疫治疗的临床应用带来了严峻挑战。 因此，亟需一种非病毒、高效、安全的定点基因整合技术路径。 结果与展望 近日，位于美国波士顿剑桥的一家初创公司Full Circles Therapeutics 开发了一种基于环状单链DNA 的非病毒基因书写技术（GATALYST）平台，为长片段基因整合领域带来重要突破。该平台运用基因工程改造的噬菌体系统生产最大约20 Kb的迷你环状单链DNA（cssDNA），通过同源重组机制实现高效精准的大片段基因整合。cssDNA非病毒载体避免了随机整合引发的基因组不稳定性，此外，cssDNA具备工业化生产的潜力，可显著提升制造效率。GATALYST平台可在多种分裂细胞中实现高效精准安全的大片段基因的定点整合。在诱导多能干细胞（iPSCs）中实现了高达70%的敲入效率，在多种临床相关的原代免疫细胞类型中也实现高效率定点整合，并且能够在多个与临床应用相关的基因组位点进行编辑，并适用于多种核酸酶编辑系统。利用电穿孔递送技术，cssDNA在CAR- T细胞中可实现CD19/CD22双靶向CAR高达50% 的定点整合，并展现出优异的体内体外抗肿瘤功效，为治疗复发或难治性多发性骨髓瘤提供了新的思路。 
图1. 使用cssDNA进行功能性CAR-T细胞工程化改造
GATALYST平台通过其cssDNA载体的灵活性，安全性及工业生产的扩展性，展现出出其在免疫细胞治疗领域的巨大潜力。该平台有望克服当前基因递送方法的局限，为癌症，自体免疫疾病，以及遗传性疾病等的基因细胞疗法提供全新的非病毒方案，进而推动精准医疗发展。
作者简介 本文的第一作者为谢克强博士，是Full Circles Therapeutics 的平台研发部负责人。谢克强博士和吴昊博士为本文的共同通讯作者。吴昊博士是Full Circles Therapeutics的首席科学官和麻省理工学院Whitehead学院访问学者，研究方向包括基因编辑、表观基因组编辑和新药研发。Full Circles Therapeutics专注于开发基于环状单链DNA非病毒基因书写技术的平台。致力于为遗传代谢疾病、癌症和自体免疫疾病 提供创新疗法。 来源：东窗史谈一点号
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