摘要：组织工程化的各向异性细胞构建体是治疗体积性肌肉损失（VML）的有效手段。然而，在宏观三维细胞构建体内实现骨骼肌组织再生所需的成功细胞排列仍然具有挑战性，这是因为在低粘度水凝胶内控制细胞排列存在困难。

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组织工程化的各向异性细胞构建体是治疗体积性肌肉损失（VML）的有效手段。然而，在宏观三维细胞构建体内实现骨骼肌组织再生所需的成功细胞排列仍然具有挑战性，这是因为在低粘度水凝胶内控制细胞排列存在困难。

来自韩国成均馆大学的GeunHyung Kim团队提出了一种磁流变生物墨水的概念，以操纵低粘度水凝胶内的细胞排列。这种生物墨水由甲基丙烯酰化明胶（GelMA）、氧化铁纳米颗粒和人脂肪干细胞（hASCs）组成。通过氧化铁纳米颗粒对外部磁场的响应性来调节细胞排列。本文开发了一种使用环形磁铁的原位生物打印工艺，从而获得了良好排列的三维细胞结构，并增强了hASCs的机械传导效应。体外分析显示，包括成肌相关基因表达在内的细胞活性得到了上调。当植入VML小鼠模型中时，生物构建体改善了肌肉功能和再生，验证了所提出方法的有效性。相关工作以题为“In situ magnetic-field-assisted bioprinting process using magnetorheological bioink to obtain engineered muscle constructs”的文章发表在2024年12月03日的期刊《Bioactive Materials》。

【创新型研究内容】

本文开发了一种改良的生物打印技术，该技术在挤出过程中利用原位M场对磁性激活颗粒进行排列。如图1a所示，本文制作了一个大腿肌肉中有VML缺陷的“患者”模型。然后使用本文新提出的原位M场辅助生物打印方法填充VML缺陷区域，证明磁性激活的生物墨水能够稳定地沉积到缺陷区域上。为了观察使用环形磁铁的M场分布，模拟结果显示了三个环状磁铁（最大磁通量为0.09 mT）的横截面M场分布，确认了施加的M场与生物墨水的流动方向平行排列，如图1b的光图像所示。此外，为了选择合适的铁氧体纳米颗粒负载在GelMa生物墨水中的浓度（5wt%）以及使用UV剂量的交联条件，本文简单地测试了不同颗粒浓度和机械性能下的铁氧体排列和hASCs细胞活力。为了确定使用M场（三个环形磁铁）生物打印构件中的细胞活力和铁氧体排列，在UV剂量（820 mJ cm⁻²）和图1b所示打印条件下，将不同浓度（50–500 ng mL⁻¹）的铁氧体纳米颗粒（0.23 ± 0.06 μm）加载到含有hASCs（1 × 10⁷ cells∙mL⁻¹）的5重量百分比GelMA溶液中。当浓度从50增加到200 ng mL⁻¹时，铁氧体的排列增加，但在500 ng mL⁻¹时保持不变。由于磁场诱导铁氧体颗粒的排列，可以假设在较低浓度（50和100 ng mL⁻¹）下，墨水的磁性较弱，而在较高浓度下，颗粒排列更大，对磁性的影响更显著。此外，1天和7天的细胞活力相对较高（约90%），从50到200 ng mL⁻¹，但在500 ng mL⁻¹时显著下降。这些结果与之前的研究相似，表明铁氧体基颗粒的浓度约为200 ng mL⁻¹通常被认为是安全的，而在更高浓度下，包括细胞活力、生长和增殖在内的细胞活动显著减少。

图1 原位磁场辅助生物打印应用的概念验证

【分析磁场分布及其对喷头内生物墨水流动性的影响】

为确定环形磁铁产生的磁场分布，在喷嘴周围放置了不同数量的磁铁，每个磁铁的几何形状固定（内径 = 6.8 mm，外径 = 10 mm，厚度 = 5.2 mm）（图2a）。使用有限元法磁学（FEMM）软件计算了打印喷嘴周围的磁通量分布。预期的结果是，磁场矢量与玻璃喷嘴方向平行排列（图2b），这有助于生物墨水中的氧化铁颗粒沿单轴排列。此外，为了观察磁铁数量对磁场分布的影响，本文进行了一到四个环形磁铁的模拟。图2b显示的结果揭示了三个环形磁铁能够产生均匀的磁场分布。为了定量评估磁场分布，图2c和d描绘了相对于磁铁中平面、垂直（x轴）和平行（y轴）于喷嘴长度的磁通量剖面。增加磁铁的数量显著提高了两个方向上的磁通强度和均匀性。特别是，沿着x轴的均匀磁通对于实现链状颗粒在生物打印支架垂直方向上的均匀分布非常重要。基于模拟结果，三个磁铁似乎足以实现生物墨水中磁性颗粒的均匀排列。

图2 磁场强度对磁流变生物墨水流动性能的评估

【使用不同磁场生物打印的细胞构建体的细胞排列和成肌活动】

为评估生物活动，特别是由于排列的颗粒链引起的地形线索导致的细胞排列以及成肌活动，对由5wt%GelMA、铁氧体（200 ng mL⁻¹）和hASCs（1 × 10⁷ cells∙mL⁻¹）组成的载细胞生物构造体的水平横截面进行了染色，这些构造体是用不同数量的环形磁铁（0-3个）制造的（图3a）。在第7天对hASCs进行了DAPI和鬼笔环肽染色、方向映射（90°为打印方向）和方向频率分析，以评估细胞排列（图3b）。DAPI/phalloidin图像的定量分析显示，与无磁铁过程相比，细胞核长宽比逐渐增加，分别为1.11倍（一个磁铁）、1.39倍（两个磁铁）和1.38倍（三个磁铁）（图3c）。此外，本文使用方向因子方程评估了沿着支柱的细胞核排列，方向因子 = (90° – φ)/90°，其中φ是方向角分布的半峰全宽（FWHM）。

图3 不同磁场强度下细胞形态和成肌活性的表征

【生物墨水中纳米和微米级氧化铁颗粒对细胞活性的影响】

图4a展示了扫描电子显微镜（SEM）图像和能量色散X射线光谱（EDS）元素映射的微米和纳米级氧化铁颗粒，以及使用磁场辅助生物打印（采用三个环形磁铁）在GelMA基质中形成的链状颗粒的光学图像。3D表面映射图像展示了每个制造结构中颗粒链的直径。对氧化铁颗粒的化学成分[铁（Fe, 红色）和氧（O, 绿色）]进行评估，证实了铁和氧的存在，确认了氧化铁的组成。颗粒的平均直径约为0.22微米（纳米级）和1.44微米（微米级）（图4b）。暴露于原位磁场后，与纳米级颗粒相比，微米级氧化铁颗粒聚集成更大的纤维（图4c）。

图4 含有纳米和微米级氧化铁颗粒的磁流变生物墨水的表征及生物学效应

【M场辅助生物打印过程的力传导效应】

生物打印过程中M场的存在可以引发铁氧体颗粒的极化，从而诱导磁力吸引。就原位M场辅助生物打印而言，它可以刺激细胞中的力传导信号通路，并诱导有利的细胞反应。为了评估这一现象，本文准备了‘G’（传统生物打印的hASCs载GelMA生物构造）、‘GIO’（传统生物打印的铁氧体/hASCs载GelMA）和‘GIOM’（原位M场辅助生物打印的hASCs/铁氧体载GelMA生物构造）（图5a）。力传导通路在细胞对机械刺激的反应中至关重要，并影响多种生物功能（图5b）。在这些通路中，Hippo信号通路、Wnt/β-连环蛋白通路和离子通道在调节细胞过程如细胞生长、分化、信号传递和稳态方面发挥重要作用。Hippo通路对机械信号敏感，通过调节增殖、分化和组织生长来控制细胞行为。由机械线索引起的细胞形状变化和细胞骨架张力调节Hippo通路的活性，从而影响基因表达和细胞命运。同样，Wnt/β-连环蛋白通路整合机械和生化信号，以控制发育和组织维护期间的细胞命运、生长和分化。机械敏感的离子通道，如拉伸激活通道，通过将机械力量转化为电化学信号，从而有助于细胞力传导，影响基因表达、细胞运动和分化。通过复杂的相互作用和调整，这些力传导通路共同指导细胞对机械刺激的反应，并在组织发育、维持和病理过程中发挥关键作用。因此，本文预测使用原位M场生物打印方法进行机械刺激的细胞可以进一步启动上述细胞信号通路，导致有利的细胞反应。

图5 原位磁场辅助生物打印对力学转导信号通路的影响

【体外细胞对原位磁场刺激的反应】

为评估G、GIO和GIOM生物构建体的各种体外细胞反应，本文在1天时观察了活/死染色，7天时进行了DAPI/鬼笔环肽染色，14天时进行了DAPI/肌动蛋白染色，以及21天时进行了DAPI/α-辅肌动蛋白染色（图6a）。活/死图像表明所有三组的细胞存活率都很高（约90%），证明制造打印过程是安全的（图6b）。在7天时，本文使用DAPI/鬼笔环肽图像来评估hASCs在生物构建体中的细胞骨架组织，并对细胞核的长宽比和取向因子进行了定量评估（图6c和d）。结果表明，培养在GIOM生物构建体中的细胞表现出显著更高的长宽比，这表明这些细胞由于地形线索而持续接受更高的机械刺激，从而影响了力学转导通路。此外，影响结构性和功能性一致的肌肉纤维形成的取向因子也相对较高（GIOM约为0.75，G和GIO分别约为0.36和0.37）。另外，MTT实验（图6e）表明所有组的细胞随时间增殖良好，与G和GIO相比，GIOM组的细胞增殖速率明显更高（7天时分别为2.1倍和1.9倍），这是由于早期的力学转导效应。

图6 在不同GelMA构建体中培养的hASCs的体外细胞活性

【活体实验】

为进一步验证体外实验的结果，本文将生物构造体（2 × 4 × 1 mm²）在打印后直接植入小鼠的VML缺损处。如图7a所示，大约40%的胫前肌（TA）被切除。随后，将生物构造体（G、GIO和GIOM）放置在缺损部位进行植入（图7b）。选择年龄匹配的（SHAM）和非治疗的（Defect）小鼠分别作为阳性和阴性对照，以评估这些构造体的再生效果。植入四周后，收获TA肌肉并进行组织学评估，使用苏木精-伊红（H&E）和Masson三色（MT）染色（图7c）。从图像中，对包括肌管直径、周围核肌纤维和纤维化区域在内的参数进行了定量评估（图7d–f）。与接受缺损治疗的小鼠相比，接受G、GIO和GIOM生物构造体的小鼠表现出更大的肌肉纤维直径，这表明通过生物构造体植入促进了肌肉再生。值得注意的是，GIOM组显示出最高的肌肉直径，与缺损组相比增加了1.66倍。此外，接受GIOM的小鼠的大多数肌纤维是周围核的，表明几乎完全的肌纤维再生。相反，在缺损、G和GIO组中观察到大量的纤维化区域，表明显著的纤维化（图7f）。有趣的是，G和GIO组之间纤维化区域的相似性表明，将铁氧体颗粒加入生物构造体中并未引起明显的纤维化。

图7 小鼠VML缺损模型中生物构建体的体内治疗效果

为了识别TA肌肉中的细胞类型和起源，使用肌球蛋白重链（MHC）、人类白细胞抗原（HLA）、人类线粒体核糖体蛋白L11（MRPL11）和CD31等标记进行免疫化学染色，以特别标记内皮细胞（图8a）。评估MHC阳性区域（图8b）显示GIOM组的表达显著高于缺损、G和GIO组，接近SHAM组的水平。值得注意的是，在SHAM和缺损组中不存在HLA和MRPL11（具有人类反应性），但在植入组（G、GIO和GIOM）中呈阳性表达，这表明植入的hASCs成功与宿主组织整合（图8c和d）。特别是，GIOM组的TA肌肉中有相当比例的细胞表现出HLA表达，这表明机械刺激促进了hASCs与宿主组织的整合。

图8 肌肉再生和血管化的免疫化学染色分析

【总结与展望】

总之，本研究表明，原位M-场生物打印在制造高度生物活性生物构建体方面具有潜力，这些构建体可以作为治疗VML缺陷的疗法。通过对磁铁设置和氧化铁颗粒大小的全面评估，hASCs的细胞排列和成肌活动得到了上调。结果表明，机械传导途径（包括Hippo信号通路和拉伸激活离子通道）在介导细胞对机械应力的响应中的重要性，通过在M-场存在下氧化铁颗粒的运动促进肌肉再生。此外，通过对小鼠VML缺陷模型的体内评估，本文揭示了补充M-场刺激的生物构建体植入对肌肉组织再生的有益效果。值得注意的是，将氧化铁纳米颗粒掺入生物构建体并没有引起不良反应，反而增强了细胞反应，这通过增加的成肌活动和改善的肌肉功能得到了证实。

来源：EngineeringForLife一点号