摘要：移植物抗宿主病（GVHD）是异基因造血细胞移植（HCT）后的一种危及生命的主要并发症。虽然成体组织干细胞已被确定为皮肤和肠道GVHD的靶点，但其在肝脏GVHD中的作用尚不明确。在一项新的研究中，北海道大学Daigo Hashimoto团队利用异基因HCT小鼠模
移植物抗宿主病（GVHD）是异基因造血细胞移植（HCT）后的一种危及生命的主要并发症。虽然成体组织干细胞已被确定为皮肤和肠道GVHD的靶点，但其在肝脏GVHD中的作用尚不明确。在一项新的研究中，北海道大学Daigo Hashimoto团队利用异基因HCT小鼠模型开发了一种靶向胆管干细胞的治疗策略，他们发现异基因HCT后，供者巨噬细胞浸润汇管区并产生TGF-β，诱导胆管干细胞损伤，而TGF-β信号通路抑制剂SB-431542可保护类器官胆管干细胞抗GVHD，减轻胆道功能障碍。该研究为治疗肝脏GVHD提供了新的靶点。
文章介绍
题目：GVHD通过TGF-β依赖性方式靶向形成类器官的胆管干细胞
杂志：Blood
影响因子：21.0
发表时间：2024年8月
#1
研究背景
Background
异基因HCT是一种治愈血液系统恶性肿瘤、骨髓衰竭综合征和遗传性免疫缺陷的方法。GVHD是进行异基因HCT的主要障碍，而肝脏是GVHD的主要靶器官之一。肝脏GVHD最突出的病理学特征包括门静脉单核细胞浸润、胆管损伤和不同程度的实质损伤。肝细胞具有高度的再生能力，而胆管上皮细胞（BECs）的再生能力有限，严重的胆管损伤会导致胆管消失综合征。越来越多的证据表明，组织特异性干细胞的再生促进了组织的弹性。GVHD主要针对肠道和皮肤中的组织干细胞，但组织干细胞或祖细胞在肝脏中的命运和病理生理作用仍有待阐明。已有研究表明，存在于胆管上皮的多能干细胞可产生肝类器官。在这里，研究人员探索了胆管干细胞（BDSCs）在GVHD中的命运，并利用异基因HCT小鼠模型开发了一种靶向BDSCs的治疗策略。
#2
研究思路
Methods
研究人员探索了能够在体外生成肝脏类器官的BDSCs在异基因HCT后的肝脏GVHD中的命运。研究人员观察到异基因HCT后早期损伤的BECs显著扩增。来自胆管的类器官形成效率在异基因HCT后早期也显著提高。随后发现胆管类器官形成的效率显著降低，同时伴有BECs的减少和血浆胆红素浓度的升高，这表明GVHD靶向BDSCs并损害了BECs的弹性。此外，异基因受体的肝脏浸润单个核细胞以TGF-β依赖的方式显著减少了类肝器官的生长。从第14天到第28天给予TGF-β信号通路抑制剂SB-431542，可保护类器官形成的BDSCs对抗GVHD，并减轻异基因HCT后的胆道功能障碍，提示BDSCs是肝脏GVHD的一个有前景的治疗靶点。
#3
研究结果
Results
1. 肝脏GVHD诱导BECs凋亡和短暂增殖
为了探索组织干细胞在肝脏GVHD中的作用，研究人员利用已建立的小鼠异基因HCT模型，将致死剂量照射的BDF1受体移植5×106个脾细胞和5×106个来自MHC不匹配的B6供者的骨髓细胞。发现与同基因对照相比，临床GVHD评分显著升高，死亡时间较晚。病理学GVHD评分在第7日开始升高，并且从异基因HCT后第2周开始显著升高，但在同基因HCT后未出现这一情况。LMCs的流式细胞术分析表明，供者CD4+和CD8+T细胞在异基因HCT后两周内浸润到肝脏。单核细胞和单核细胞来源的炎症巨噬细胞（被鉴定为F4/80+ CD11bhigh细胞）的浸润在两周时未观察到，但在第28日变得明显。与此同时，肝脏驻留库普弗细胞（被鉴定为F4/80+ CD11blow细胞）在异基因动物中与同基因对照相比没有显著增加。使用B6-Lck-cre×R26tdTomato小鼠作为供体，通过免疫荧光研究评估浸润的供体T细胞和巨噬细胞在肝脏中的定位，结果显示在肝脏汇管区，大量tdTomato+供体T细胞和F4/80+巨噬细胞浸润在细胞角蛋白19（CK19）+胆管周围，异基因动物的这些门脉浸润巨噬细胞在形态学上与同基因和异基因动物窦壁表面的相对细长的库普弗细胞不同。
为了评估肝脏GVHD中BECs的损伤，研究人员用免疫荧光技术检测了凋亡的标志蛋白cleaved caspase-3（cCasp3），在HCT后第21天，与同基因或naïve对照相比，表达cCasp3的异基因小鼠的BECs显著增加。异基因小鼠的BECs表达Mmp7，这是第21天BEC损伤的特异性标志物。qPCR分析证实了异基因HCT后肝脏内的Mmp7升高。研究表明，在多种类型的肝损伤后，都会出现BECs的扩增，称为胆管反应。CK19的免疫荧光分析表明，在第21天，BECs的损伤与BECs的短暂扩增有关，然而，这些反应性的BECs在异基因HCT后第35天减少，表明肝脏GVHD也抑制了BECs的再生反应。重要的是，仅在第21天的异基因小鼠中观察到Ki-67+的BECs簇，这表明BEC损伤诱导了位于胆管上皮内的BEC祖细胞的增殖。随着BECs减少，在异基因移植的较晚时间点观察到血浆胆红素浓度升高，这是肝脏GVHD的标志。第70日，异基因动物中剩余的CK19+ BECs不典型地表达肝细胞特异性标志物白蛋白，提示BEC祖细胞具有多能分化能力（图1）。这些结果表明，BEC损伤在异基因小鼠中诱导BDSCs增殖，随后GVHD在较晚的时间点靶向这些细胞。
图1 肝脏GVHD诱导BECs凋亡和短暂增殖
2. GVHD通过TGF-β依赖的方式靶向形成类器官的BDSCs
已有研究表明，肠道GVHD中组织干细胞减少会导致肠道类器官生成效率降低，因此研究人员下一步研究了肝脏GVHD中类器官生成效率是否可以改变。发现从异基因动物的肝右叶胆管生成的肝类器官数量从第7天到第21天呈上升趋势，而从第28天到第42天呈下降趋势。值得注意的是，与naïve小鼠和同基因对照在第28 ~ 35日的类器官的总平均数量相比，类器官的数量在较晚的时间点（第28 ~ 42日）显著减少。相比之下，同基因对照产生的类器官数量与naïve小鼠产生的类器官数量相当。接下来，研究人员探索了GVHD减少异基因小鼠肝脏类器官形成的机制。使用第28天从肝脏提取的总RNA进行的q-PCR表明，在异基因受体中，IFN-γ和TNF-α的表达显著升高。之前的报告显示促炎细胞因子如IFN-γ和TNF-α诱导肠道类器官的凋亡，研究人员探索了这些细胞因子对来源于naïve BDF1小鼠的肝类器官生长的影响。与肠道类器官不同，即使在高浓度下，这两种细胞因子也不会对肝脏类器官的生长产生影响。与naïve和同基因对照相比，异基因动物肝脏中TGF-β的表达水平显著升高，当将TGF-β添加到从naïve小鼠生成的类器官时，TGF-β显著减少了类器官的形成。尽管存在TGF-β，选择性SMAD2/3抑制剂SB-431542仍以剂量依赖性方式恢复了类器官的形成，这表明经典TGF-β途径抑制了肝类器官的形成。有趣的是，TGF-β受体的表达在异基因HCT后上调，而在同基因移植后没有。在naïve小鼠制备的肝类器官中，TGF-β受体表达也上调至与从异基因受体新鲜收获的BECs相同的水平，这解释了这些naïve小鼠来源的类器官对TGF-β的易感性（图2）。
图2 GVHD通过TGF-β依赖的方式靶向形成类器官的BDSCs
3. 产生TGF-β的炎症巨噬细胞减少肝类器官的形成
接下来，研究人员探索了肝脏GVHD中TGF-β的产生细胞。F4/80和TGF-β的免疫荧光研究表明，大多数门脉浸润巨噬细胞TGF-β阳性，如皮肤慢性GVHD。流式细胞术分析表明，与同基因对照相比，异基因小鼠肝脏中产生TGF-β的炎性巨噬细胞的绝对数量显著增加，而同基因和异基因受体之间产生TGF-β的库普弗细胞的数量相当。接下来，研究人员进行了共培养实验，以研究来自受者的LMCs是否对肝类器官的生长有影响，发现异基因受者而非同基因受者的LMCs显著抑制了来自naïve小鼠的肝类器官的生长。当LMCs分为T细胞和非T细胞（后者由65%的巨噬细胞组成）时，只有与非T细胞共培养，而不是纯化的T细胞，显著减少了类器官的数量，进一步证实了巨噬细胞在TGF-β生成中的主要作用。SB-431542显著恢复了异基因受体LMCs存在时观察到的类器官形成减少，突显了这些细胞产生的TGF-β对肝类器官形成的抑制作用（图3）。综上所述，这些发现表明，在肝脏GVHD中，肝类器官形成能力的下降与浸润肝脏汇管区的产生TGF-β的炎症巨噬细胞有关。
图3 炎症巨噬细胞通过TGF-β依赖的方式减少肝类器官的形成
4. BDSCs的保护作用减轻了肝脏GVHD时的胆道功能障碍
接下来，研究人员在体内测试了用SB-431542抑制TGF-β是否可以保护形成类器官的BDSCs免受肝脏GVHD。从异基因HCT后第14日开始，每日向小鼠腹腔内注射SB-431542。发现SB-431542显著恢复了异基因HCT后第28日类器官形成的效率，表明抑制TGF-Β可保护形成类器官的BDSCs免受GVHD。此外，SB-431542显著降低了异基因动物中凋亡BECs的比例，抑制了肝脏中Mmp7的表达，并降低了血浆胆红素水平，表明通过抑制TGF-β对形成类器官的BDSCs的保护导致了肝脏GVHD中胆道功能障碍的缓解。病理性GVHD评分在SB-431542处理的异基因小鼠中得到了显著改善。随后，研究人员在另一个小鼠急性GVHD模型（B6受体来自BALB/c供体）中证实SB-431542保护BDSCs免受GVHD，并减轻BEC损伤和肝脏GVHD，从而排除了SMAD2/3抑制对BDSCs的品系特异性影响（图4）。
图4 BDSCs的保护和扩增减轻了肝脏GVHD时的胆道功能障碍
小结
研究人员证明了肝脏GVHD中形成类器官的BDSCs的出现和耗竭，以及一种新的依赖TGF-Β的供者免疫细胞损伤肝脏类器官形成能力的机制，为将保护BDSCs作为预防和治疗肝脏GVHD的新策略奠定了基础。
参考文献
Hasegawa, Y., et al., GVHD targets organoid-forming bile duct stem cells in a TGF-β-dependent manner. Blood, 2024. 144(8): p. 904-913. Doi: 10.1182/blood.2023023060.
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来源：培养盒守护者
