揭示微生物代谢组学的确定性动态：厌氧生物降解的多组学研究

摘要：背景：微生物厌氧代谢是生物地球化学循环的主要驱动力，影响着生态系统的功能以及自然和人工环境的健康。然而，人们对微生物与有机代谢物之间错综复杂的动态相互作用仍然知之甚少。利用宏基因组学和代谢组学方法，在为期 96 天的厌氧生物反应器实验中，我们揭示了微生物代谢变

作者：Xingsheng Yang等

期刊：Microbiome

时间：2024.09.07

影响因子：13.8

组学：16S、宏基因组、代谢组

摘要

背景：微生物厌氧代谢是生物地球化学循环的主要驱动力，影响着生态系统的功能以及自然和人工环境的健康。然而，人们对微生物与有机代谢物之间错综复杂的动态相互作用仍然知之甚少。利用宏基因组学和代谢组学方法，在为期 96 天的厌氧生物反应器实验中，我们揭示了微生物代谢变化的原理。

结果：在代谢物的流动和组装过程中，同质选择占主导地位，在第 12 天达到 84.05%。在微生物和代谢物的组装过程及群落组成上，我们观察到它们之间始终保持动态协调。我们的研究结果表明，微生物推动了代谢物的更替，这使并行反应器中的分子转化保持一致。此外，由于含 N 有机物生物转化在热力学上更优，微生物降解的优先级是从含 N 到含 S 化合物。同样，由于营养耗竭和热力学劣势，C18 类脂质分子的代谢策略也可能从合成转向降解。这表明群落生物转化热力学是分解代谢和合成代谢的关键调节因素，在群落水平上影响着代谢策略的转变。此外，微生物-代谢物共现网络的中心是甲烷生成，是网络的枢纽，与所有节点中 62.15%的节点建立了一阶和二阶相邻关系。微生物根据其代谢能力的不同形成不同的模块并使具有不同特征的分子聚集。它们与高分子量分子建立了正向的关系，这促进了资源获取和能量利用。这种代谢互补和物质交换进一步突出了微生物相互作用的合作性质。

结果

1.总溶解有机质量（DOM）的代谢物组成内在特征发现

宏代谢物作为一个共享的原料池为微生物的新陈代谢提供了广阔的空间，其中有数千种或更多的代谢物经由微生物生成、交换和吸收。研究的第一步应该是了解 DOM 代谢物池的组成。利用高分辨率质谱，在八个不同时间点（第 0、3、6、9、12、24、48 和 96 天）从所有厌氧消化（AD）生物反应器收集的 48 份样本中，共鉴定出 11,086 个 DOM 分子。结果表明，许多分子式有类似木质素和脂质的组成。对这些分子式的基本元素组成进行重点研究，结果显示大部分分析物都含有氧元素（O）（图 1A）。按降序排列，该 AD 系统中分子元素组成的主要类别包括 CH(O)、CH(O)N、CH(O) NS和 CH(O)S。相比之下，只有极少部分已鉴定的 DOMs含有 P 元素。含有 18 个 C 原子的分子数量最多，随着所含C 原子数偏离18，分子数量逐渐减少（图 1A）。在 H 和 O 元素上也观察到了类似的趋势（图 1A）。此外，这些分子并不明显偏向于不饱和，大多数 DOM 分子都含有还原 C（图 1B）。因此，我们可以认为该厌氧消化（AD）系统中的代谢物是可生物降解的。

代谢物的组成经历了连续而有节奏的变化。具体来说，在最初阶段（第 0-3 天）代谢物的丰富度有所增加，随后在整个过程中出现波动和减少（图 1C）。这表明大多数代谢物都是通过包含水解的生物过程产生的。随着时间的推移，系统的分子组成趋向简单。与大多数类别物质的变化趋势都与总丰富度变化趋势一致不同，类脂物质的丰富度在第 0-9 天有所增加（图 1D），同时相对丰度也稳步增加直到第 12 天（图 1E）甲烷开始生成时。因此，该系统中类脂成分的产生经历了一个漫长的阶段，在此期间，大多数物质被水解，其他类别的物质减少。我们进一步分析了每个时间点按碳链长度划分最丰富的五种类别。结果显示，在整个实验期间，C18 成分的产量最高（图 1F）。此外，我们还观察到最丰富的碳链类别的长度有明显的变化。除C18外，最初占主导地位的其他碳链类别逐渐让位于不同的类别。这些结果表明，在厌氧消化过程中，新陈代谢转化遵循一定的动态规律。

图1. 分子基本特征和 AD 过程中的总体变化

2.从代谢物转化的时间特征推断微生物的宏代谢策略

除了揭示代谢物组成的变化外，我们还试图探索整个动态过程中的分子转化模式，从而揭示微生物的宏代谢策略。我们计算了加权平均成分值，以评估整个过程中分子转化的总体趋势。我们发现，在整个过程中，总体分子量有所降低（表 1），这表明厌氧微生物减少了有机物的总量，并将大分子转化为小分子。特别的是，我们观察到在早期阶段（0-12 天），C 和 O 急剧减少，而C 和 H 减少主要发生在之后的阶段（9-96 天），我们还发现，不饱和度、氧化还原状态和碳利用效率呈现先下降然后在第 12 天左右上升的趋势（表 1）。不饱和度和氧化还原状态的数值越低，表明分子的易变性越高，而碳利用效率的数值越低，表明生物量积累所涉及的代谢反应的热力学效率越高。因此，我们的研究结果表明，在甲烷产生之前，早期的微生物代谢可能会使整个有机物成分更容易被生物降解。

之后，我们对特定时间节点的生物转化进行了详细研究，以研究微生物的代谢权衡。我们计算了每个样本质量的配对距离，并将结果映射到 866 种常见的生化转化上（图 2A）。进一步研究发现，这些转化具有时间特异性（图 2B）。微生物群落进行的代谢转化可视为其代谢策略的体现。因此，不同的代谢作用表明微生物群落在整个实验过程中采取了不同的代谢策略。随后，我们尝试计算群落水平的生物转化热力学，以探索潜在的代谢策略。考虑到系统内分子生物降解的整体过程，分析表明，在微生物厌氧分解过程中，含 N 的生物转化从热力学上来说比含 S 的生物转化更容易发生（图 2C），结合N和S元素转化的时间模式（氮元素的生物转化集中在实验的早期阶段，而含硫元素的生物转化在后期阶段），这表明微生物对可利用资源进行了优先级排序。同时，在厌氧分解过程中，含磷（P）分子的生物降解没有表现出时间特异性，这是热力学障碍较低的微生物代谢活动的典型表现（图 2C）。C18 类脂分子从被合成到被降解的转变为这一观点提供了更多证据（图2D），证明热力学条件可能决定微生物的代谢策略。这些关于宏代谢的研究结果表明，微生物根据特定的物理条件（如系统热力学和可用资源）选择并执行代谢策略。

图2. 基于生物转化分析的代谢转化的热力学和瞬态特征

3.用群落生态学来理解微生物宏代谢

群落生态学为我们提供了关于代谢物组成的新视角。就微生物群落的组成而言，同质选择和异质选择意味着代谢物组成在生物和非生物因素的影响下趋同或分化。同质化扩散和扩散限制程度表明分子是否容易在环境中扩散和迁移，从而形成群落分子组成。其余部分（漂移及其他）可表明分子经历了随机转化、未观察到的过程或意外事件，从而形成观察到的分子组成。我们发现，同质选择主导了系统中代谢物的组装。然而，同质选择的比例先增加后减少，而漂移和其他选择的比例则继续增加，在第 96 天达到与同质选择占比相似的水平（图 3A）。这些结果表明，环境和生物过程对有机物的影响可能在决定大分子向小分子转化的程度方面起着主导作用。确定同质选择在分子转化过程中占主导地位的基础上，我们接下来探讨微生物过程的作用。首先，曼特尔检验证实了分子和微生物组成的共同更替（p

在确认了微生物群落和分子组成之间的共同转变之后，我们分析了它们的生态功能之间的相关性。系统发育上密切相关的微生物往往具有相似的生态位。同样，分子化学特征（如大小、可用性和能量供应）也影响着它们在生化过程中的特定行为，包括合成、降解和扩散。一个合理的推论是，在多个维度上具有相似分子性状的分子具有类似的生态功能。这些推论为利用微生物系统树和分子性状树研究微生物和分子之间的生态功能关系提供了基础。基于 Spearman 相关性的 Mantel 检验表明，两个成分的 βNTI 值之间存在显著相关性（p = 0.001）（图 3C），表明它们在生态功能上相互依存。由于 βNTI 也用于推断组装过程，因此两个组分的 βNTI 值之间的相关性也表明微生物群落与 DOM 组成之间的组装过程是协调的。。我们的研究发现，当微生物和代谢物其中一个受到选择压力时，另一者在同一过程中结构发生变化的比例为 78.43%和 43.89% 。这些结果表明，由于生态功能的相关性，微生物和代谢物两者的组装机制可以相互影响。特别是，每种成分都是另一者选择过程中的关键因素，使微生物群落和分子组成之间的共同转换达到协调。

图3. DOM代谢物的组装机制和与微生物群路的相关性

4.将微生物功能与代谢物特征联系起来

在确认微生物与DOM 代谢物在流动和组装过程中的互作关系后，我们进一步构建了共生网络，以推断这两者之间的内在关系。我们将微生物作为一组，将有机分子和环境变量作为另一组，以获得两组之间稳健的时间序列网络。我们发现，该系统的微生物-代谢物网络以为网络中心（图4A）。该网络连接紧密，总节点的 62.15%是的一阶和二阶邻居。在扩展到四阶邻居后，几乎可以连接所有节点（99.49%）（图 4A）。同时，该网络中的所有连接枢纽都属于有机物（图 4A）。微生物则是网络中大部分模块的枢纽（图4A）。不同模块中分子特征的显著差异（图 4B）证明，代谢活动可能呈模块化分布。总的来说，该系统是围绕生成构建的，不同的微生物代谢活动将微生物和物质聚集到不同的模块中，形成网络结构，并推动分子转化为更小的物质。

对网络中确定的关键物种，我们进一步将这些关键物种与使用宏基因组学方法组装得到的基因组（MAGs ）进行匹配，以将它们于代谢功能联系起来。通过比对 16S rRNA 基因序列和注释，7 个 ZOTU 与 4 个 MAG 成功匹配。所有匹配上的 MAG 质量都很高，完整度为 80.24% 至 95.28%，污染度为 0.67% 至 3.52%。这些关键物种很可能在动态的物质代谢中发挥重要作用，因为它们一般都有相对完整的脂肪酸生物合成通路，并在碳水化合物代谢和发酵方面展现出不同程度的能力（图 4D）。特别值得注意的是， MAG4 是碳水化合物代谢的多面手，能够利用 15 种不同的底物，包括木聚糖、木葡聚糖、纤维素等各种多糖。因此，我们可以认为几种重要的微生物具备广泛的代谢能力从而执行了系统内的关键功能并组织出系统的代谢框架。