腺相关病毒（recom adeno-associated virus, rAAV）是目前应用较为广泛的病毒载体之一，作为基因治疗的载体，具有较高的生物安全性和稳定性、较低的免疫原性、较广的宿主范围、较强的特异性、可长时间表达外源基因等优点。因此，在基因治疗的研究过程中备受关注，并在多种遗传性疾病中取得了临床成功。然而，大量生产高质量的 AAV 仍然是一个挑战。想了解生物技术研究、开发和生产内容可以去默克www.sigmaaldrich.cn查看。rAAV下游工艺（见图1）目的为去除或降低工艺相关杂质和产品相关杂质，包括空壳病毒，宿主细胞DNA和宿主细胞蛋白等，特别是降低空壳病毒比例对下游工艺有很高的挑战。这些下游工艺步骤的成本占生产总成本比例较高，因此需要高效制备高纯度rAAV的工艺。摘要：腺相关病毒（recom adeno-associated virus, rAAV）是目前应用较为广泛的病毒载体之一，作为基因治疗的载体，具有较高的生物安全性和稳定性、较低的免疫原性、较广的宿主范围、较强的特异性、可长时间表达外源基因等优点。因此，在基因治疗的研
病毒收获时，通过化学方法裂解细胞，释放rAAV，同时宿主细胞DNA也会被释放出来，默克的Benzonase®核酸酶可以高效消化核酸片段，显著提高澄清过滤器的载量和性能，有利于后续切向流过滤的浓缩效果，极大程度上较低超滤后料液的宿主DNA含量。澄清步骤可以使用默克Millistak+®D0SP和Clarislove®20MS滤器快速地去除一些杂质，例如细胞碎片，胶体、亚微米颗粒和宿主细胞蛋白等，过滤载量高于250L/m2。较为“疏松“的孔径弱化了带负电荷rAVV与滤器的静电吸附，实现了80%以上的收率。
在澄清之后，层析之前进行超滤1，可以去除残留的Benzonase®核酸酶、宿主DNA片段和宿主蛋白，同时该步骤可以浓缩rAAV，减少层析上样体积，从而缩短层析工艺时间。其次在超滤2中，可以实现将样品进行换液和浓缩。默克的Pellicon®系列（100kd和300kd）和一次性超滤膜包Pellicon® Capsule（100kd和300kd）可以满足工艺需求。Benzonase®核酸酶清除率可以达到≥96%，rAAV收率≥98%。
下游工艺的主要挑战之一是提高空壳去除率。这些空壳病毒属于产品相关杂质，可能影响rAAV的安全性和有效性。最早使用的分离技术是氯化铯或碘克沙醇密度梯度离心，但难以放大，而层析是大规模生产的首选方法，利用空壳病毒（PI 6.3）和完整衣壳病毒（PI 5.9）之间表面电荷的细微差异这种性质（图2），可以通过离子交换层析来实现分离。图A：Eshmuno®Q上的模拟和实验色谱图
红线 – 实验 OD 280 nm；蓝线 – 实验OD 260 nm
图B:上样和洗脱液的 AEX- HPLC 分析
在另一案例中，我们发现Fractogel® TMAE(s)对rAAV8型的完整衣壳病毒和空壳病毒也有很好的分离效果，这个案例中样品滴度为1.8E+3vp/ml，完整rAAV含量约为15%，采用了Fractogel® TMAE（S）离子交换填料进行了测试，该研究中讨论了梯度和分步洗脱。根据初步线性洗脱研究结果，观察到空衣壳在完整衣壳前洗脱，因此，混合纯化策略被设计为在梯度洗脱洗涤中选择性地去除空壳病毒。在通过梯度洗涤去除空壳后，可以在洗脱步骤中采用简单的等度洗脱方式回收完整的rAAV（图4）。ddPCR/ELISA分析洗脱液中有42%的完整衣壳病毒，而SEC-MALS方法显示54%的完整衣壳病毒。
结论
rAAV下游纯化工艺中经核酸内切酶将裂解后释放出的DNA切割成较小的片段后，可通过澄清过滤和超滤步骤去除宿主细胞蛋白和DNA片段。对于rAAV空壳病毒与完整衣壳病毒的分离，阴离子步骤是目前常用的方式。Eshmuno®Q，Fractogel® EMD DEAE和Fractogel® EMD TMAE（S）根据不同血清型的差异，在这一步骤上可实现rAAV的完整衣壳的富集和空壳的去除。默克可以提供上述完整下游纯化工艺解决方案。
默克还提供了GMP级别的VirusExpress® HEK293细胞株和的Sf-RVN®昆虫细胞株，以及配套的Cellvento®4HEK细胞培养基，还有密闭系统应用于病毒载体工艺。
参考
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[2]R. Dickerson, C. Argento, J. Pieracci, M. Bakhshayeshi, Separating empty and full recombinant adeno-associated virus particles using isocratic anion exchange chromatography, Biotechnol. J. 16 (2021) 1–9
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来源：不能胖胖胖