摘要：今天推荐的是由梅州嘉应学院生命科学学院细胞与分子生物学实验室在2023年4月6日发表于Cell Death and Disease（2021IF：9.6963，JCRQ1）的一篇文章，通讯作者是Xuekui Liu教授，研究表明依赖于USP7和PRMT5的G3

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今天推荐的是由梅州嘉应学院生命科学学院细胞与分子生物学实验室在2023年4月6日发表于Cell Death and Disease（2021IF：9.6963，JCRQ1）的一篇文章，通讯作者是Xuekui Liu教授，研究表明依赖于USP7和PRMT5的G3BP2稳定化驱动HNSC的新脂肪生成和肿瘤发生。

研究背景

GTP酶激活蛋白结合蛋白2（G3BP2）是一种关键的应激颗粒相关的RNA结合蛋白，负责形成应激颗粒（SGs）。新的证据表明，翻译后修饰（PTMs）在基因转录、整合代谢和免疫监视中发挥着关键作用。

摘要部分

研究人员的分析确定了PRMT5介导的G3BP2-R468me2增强了与去泛素化酶USP7的结合，从而确保G3BP2的去泛素化和稳定。G3BP2的去泛素化和被USP7稳定需要依赖于PRMT5活性的甲基化。数据表明，PRMT5-USP7-G3BP2调控轴是肿瘤发生过程中的脂质代谢重编程机制，并为头颈部鳞癌的代谢治疗揭示了一个有前景的治疗靶标。

研究内容

1.PRMT5与G3BP2结合并使其甲基化

研究人员发现PRMT5在喉癌细胞中高度表达，并参与调控蛋白质的精氨酸甲基化。为了探索G3BP2是否是PRMT5的新底物，研究人员进行了免疫沉淀实验,随后的质谱分析确定了G3BP2，一种RasGAP结合蛋白，是PRMT5的一个强有力的相互作用伴侣。PRMT5和G3BP2之间的物理联系在HEK293细胞中通过共同免疫沉淀得到验证。研究人员进行了Western blot分析，证实了PRMT5和G3BP2在Tu686和Tu212细胞中的这种相互作用。

接下来，研究人员检查PRMT5的哪个结构域负责与G3BP2的结合。研究人员产生了三个GST标记的截断的PRMT5，用于pulldown实验，它是由aa1到292，293到420和421到637区域组成。结果显示，FL-PRMT5和带有酶活性区域（421-637aa）的构建体都能与G3BP2发生特异性相互作用。这些数据有力地证明了PRMT5与G3BP2的相互作用，并且PRMT5的酶活性区是G3BP2-PRMT5相互作用的必要条件。

由于GR和/或GRG重复代表了PRMT5潜在的首选甲基化位点，研究人员发现PRMT5能使G3BP2甲基化，这是由一个定制的甲基G3BP2抗体检测出来的，该抗体能特异性地识别对称的二甲基R468。随后对来自HEK293和Tu686的免疫纯化的G3BP2蛋白的质谱分析都表明，精氨酸-468（R468）残基是一个对称的二甲基化位点。值得注意的是，G3BP2-R468在进化上是保守的，从Rattus norvegicus到Homo sapiens。接下来，研究人员通过将Flag-PRMT5和G3BP2共同转染到HEK293中来验证G3BP2上的PRMT5甲基化位点，在其中检测G3BP2的甲基化水平。在体外甲基转移酶试验中，R468K突变体与WT相比，也显示出较低的G3BP2甲基化程度。此外，在GSK3326595（一种PRMT5甲基转移酶的特异性抑制剂）的存在下，G3BP2的甲基化程度急剧下降。

研究结论：G3BP2与PRMT5以酶活性依赖的方式相互作用并被其甲基化。

2.G3BP2的PRMT5依赖性甲基化促进其被USP7去泛素化

研究人员抑制了PRMT5在Tu686和Tu212细胞的表达。发现敲低PRMT5导致G3BP2蛋白减少，但不影响G3BP2mRNA水平。此外，保护泛素化的G3BP2免于降解的去泛素化酶（DUB）仍然难以确定。研究人员使用蛋白酶体抑制剂MG-132来确定PRMT5的耗竭对G3BP2的影响。同样地，研究人员用特定的短干扰RNA（siRNA）敲低PRMT5，并测量G3BP2蛋白的半衰期。在Tu686细胞中，PRMT5耗尽的细胞中G3BP2蛋白的半衰期要比对照组短。此外，研究人员通过在Tu212细胞中过量表达指示的片段来检测PRMT5对G3BP2泛素化的影响。与对照载体和截断组相比，转染PRMT5-WT和含有酶区片段的构建体明显抑制了G3BP2的泛素化。然而，PRMT5的敲低导致Tu686细胞中G3BP2泛素化的增强。因此，上述结果表明，PRMT5可以通过泛素介导的途径稳定G3BP2。

研究人员推测PRMT5在转录后水平与一个未知的DUB共同作用，以调节G3BP2的表达。研究人员将一系列的DUBscDNA质粒转染到HEK293细胞中，意外地发现USP7、USP8、USP39能上调G3BP2的表达。值得注意的是，这些DUBs中只有USP7减少了G3BP2的泛素化。在变性条件下也得到了类似的观察。

考虑到USP7通过促进其去泛素化来稳定其底物，包括p53、Sirt1、MDM2，研究人员推测USP7可能影响G3BP2的泛素化。研究人员检测了USP7对G3BP2稳定性的影响。在Tu686和Tu212细胞中，USP7的缺失降低了G3BP2的蛋白水平，而mRNA的表达几乎没有变化。USP7敲低G3BP2蛋白的减少可能是由于G3BP2稳定性的降低，这表明USP7通过抑制G3BP2通过蛋白酶体的降解而稳定G3BP2。研究人员随后评估了P5091，一种USP7的抑制剂，是否会降低G3BP2的表达。一致的是，MG132，一种蛋白酶体抑制剂，阻止了P5091诱导的G3BP2在两个细胞系中的减少。此外，研究人员发现在体外去泛素化分析中，与重组USP7孵育时，G3BP2泛素化减少。此外，敲低USP7会增加Tu686细胞中G3BP2的泛素化。

研究结论：USP7通过抑制蛋白体的降解来调节G3BP2的稳定性。

3.G3BP2的去泛素化取决于PRMT5对其的甲基化作用

研究人员产生了三个截断的G3BP2片段，从287到482aa的富含精氨酸的moief（包含PRMT5甲基化位点）是G3BP2与USP7相互作用的必要条件，这表明G3BP2甲基化和去泛素化之间存在潜在的联系。因此，在Tu686细胞中，PRMT5的耗竭延缓了USP7和G3BP2之间的互动。G3BP2-R468K突变体在有PRMT5的情况下，明显减少了USP7-G3BP2的相互作用。此外，PRMT5敲低后，G3BP2的去泛素化水平也减弱了。同样，G3BP2-R468K突变在有PRMT5的情况下减少了G3BP2被USP7的去泛素化。这些结果表明，PRMT5依赖的G3BP2甲基化对于G3BP2与USP7的相互作用和去泛素化至关重要。

研究结论：G3BP2在脂肪生成和PRMT5驱动的喉部肿瘤发生过程中起着核心的表观遗传调节作用。

4.PRMT5-G3BP2复合物激活了脂质代谢的重编程

研究人员进行了KEGG代谢组学分析。发现属于脂质代谢过程的甘油磷脂代谢途径被明显富集，表明G3BP2在HNSC细胞的脂肪生成过程中起着关键作用。此外，RNA-seq表明，G3BP2赋予脂质代谢，如脂肪酸代谢、脂肪酸延伸、不饱和脂肪酸的生物合成和癌症的中心碳代谢，表明G3BP2在癌细胞的代谢重编程中具有全局功能。G3BP2上调了Tu212细胞中ACLY、FASN、ACSL3、SCD1和PPARγ的mRNA水平。免疫印迹分析表明，G3BP2增加了FASN、ACLY、PPARγ和SCD1的蛋白水平，表明G3BP2-WT比G3BP2R468在新的脂肪酸生物合成中显示出更强的作用。接下来，研究人员探讨了这些生脂基因的转录活性是否被PRMT5通过R468的修饰所调节。与以前对肺腺癌的研究一致，研究人员发现敲低PRMT5会减弱Tu686细胞中SREBP1的活性。相反，PRMT5野生型异位表达后，ACLY和FASN荧光素酶的活性急剧增加，但没有酶的无活性突变体。此外，无论是G3BP2-WT还是R468K介导的ACLY和FASN转录活性都因PRMT5的耗竭而受到影响。同样，实时PCR分析显示，当PRMT5耗竭时，G3BP2-WT而不是G3BP2-R468K使两个目标生脂基因升高。说明PRMT5-G3BP2的相互作用作为一个主要的辅助因子复合物被招募到生脂基因的启动子上，用于脂质代谢的重编程。

研究人员接下来测试了G3BP2甲基化对脂质代谢的可能调节。G3BP2-WT提高了Tu686细胞中甘油三酯和脂肪酸的水平，但没有提高胆固醇的水平，支持G3BP2的甲基化诱导了肿瘤细胞中脂质代谢的重编程。还确定了PRMT5的敲低效率。同样，在PRMT5（KO）-Tu686细胞中，G3BP2-WT和PRMT5的异位表达与G3BP2R468K组相比，提升了甘油三酯和脂肪酸，但没有提升细胞内胆固醇。为了进一步确认G3BP2在脂质积累和脂滴（LDs）形成中的功能，研究人员对PRMT5敲低的Tu686和CAL-27细胞进行了油红O染色分析。研究人员发现在Tu686和CAL-27细胞中，当G3BP2被抑制时，脂滴的形成急剧减少且数量较少，而在PRMT5（KO）-Tu686和G3BP2过表达的CAL-27细胞中有更多的脂滴形成。与此相一致的是，G3BP2-WT与PRMT5的共同转染增强了脂滴的水平，表明G3BP2R468的甲基化是PRMT5-G3BP2复合物介导的脂滴形成积累的必要条件。

研究结论：上述结果证明了PRMT5和G3BP2对脂肪生成的协同激活作用。

5.PRMT5和USP7对G3BP2的稳定促进了癌细胞的致瘤作用

研究人员进一步探讨了PRMT5-G3BP2相互作用对肿瘤发生的功能。G3BP2-WT的异位表达增加了PRMT5介导的细胞增殖。此外，过量表达G3BP2-WT诱导的增殖在缺乏PRMT5时被阻断，这表明G3BP2的甲基化参与了PRMT5促进癌细胞生长的事件。此外，G3BP2-WT和PRMT5共转染的细胞极大地促进了迁移和侵袭，而G3BP2-R468K+ PRMT5和G3BP2-WT+ siPRMT5组细胞呈现出比G3BP2-WT细胞更快的迁移能力。同时，研究人员测量了一系列与转移相关的基因，这些基因被报道为与上皮-间质转化（EMT）有关。结果发现，G3BP2-R468K和PRMT5显然取消了EMT相关基因的表达水平。因此，研究人员得出结论，G3BP2R468的甲基化会促进体外癌细胞的增殖和迁移。

研究人员在Tu686细胞中进行了G3BP2-WT和甲基化缺陷突变体G3BP2-R468K的稳定细胞系。G3BP2和USP7的耗竭独立地延缓了肿瘤的生长，但USP7沉默的功效被G3BP2的表达所拯救。接下来，研究人员确定了PRMT5依赖的G3BP2-R468在体内甲基化的作用。与G3BP2-R468K突变相比，G3BP2-WT极大地挽救了PRMT5沉默对肿瘤生长的抑制作用。通过使用Ki-67抗体进行IHC分析来观察肿瘤的增殖情况。正如预期的那样，来自G3BP2-R468K组的肿瘤比来自G3BP2-WT组的肿瘤增殖得少。Oil red O染色法评估了肿瘤中的脂质积累，而G3BP2-WT挽救了PRMT5沉默介导的细胞内脂质积累。

研究结论：PRMT5介导的G3BP2-R468甲基化是其在HNSC细胞模型中激活和致癌功能的一个重要步骤。

6.G3BP2的表达与HNSC标本中的PRMT5和USP7相关联

研究人员探讨G3BP2R468、PRMT5和USP7的甲基化在HNSC组织中是否呈正相关关系。使用R468-G3BP2抗体对50对HNSC样本和邻近的正常组织进行IHC染色分析。大多数HNSC活检在HNSC组织细胞的细胞质和细胞核中都显示出PRMT5、USP7和G3BP2的阳性染色，而在相邻的正常HNSC组织细胞中则是弱的扩散。研究人员观察到甲基化G3BP2的水平与HNSC标本的肿瘤分级相关，生存分析表明甲基化G3BP2的水平升高与总生存率低有关。同样，研究人员验证了在TCGA-HNSC队列中，G3BP2在HNSC中的表达高于正常组织，而且G3BP2的高表达与肿瘤等级有关。同样，在TCGA-HNSC组织中，USP7和PRMT5的表达也比正常组织增加。此外，还进行了Pearson相关分析以验证PRMT5、USP7和G3BP2在TCGA-HNSC样本中的关联。免疫印迹试验验证了HNSC样本中甲基G3BP2、PRMT5、USP7和脂质代谢相关蛋白的上调。甲基G3BP2的水平与ACLY的水平呈正相关，但与FASN无关。油红O染色法用于评估细胞内脂滴的形成，在肿瘤中积累的脂滴明显多得多。所有这些发现表明，G3BP2的PRMT5依赖性甲基化是导致HNSC肿瘤性的部分原因。HNSC中G3BP2的表达失调是由高水平的PRMT5和USP7驱动的。基于这些结果，研究人员提出了一个表观遗传学的新脂肪生成和肿瘤发生模型。PRMT5的异位表达与G3BP2相互作用，G3BP2依次被USP7去泛素化和稳定，然后招募甲基-G3BP2-PRMT5-USP7复合物到致脂基因启动子，从而激活脂肪生成和肿瘤发生。

研究结论：G3BP2的表达与HNSC标本中的PRMT5和USP7相关联。

结论与讨论

代谢重编程的过度激活，包括无脂肪生成途径是人类癌症的一个标志，它可以由基因改变或翻译后修饰引起。在这项研究中，研究人员进行了实验证明，USP7介导的G3BP2去泛素化和稳定化被PRMT5的耗竭或PRMT5的甲基转移酶活性的化学抑制所削弱。PRMT5和USP7作为G3BP2的敏感"开关"，调节其稳定和脂质代谢的重新编程，从而导致脂肪生成和HNSC的侵略性恶性。PRMT5-USP7-G3BP2信号对肿瘤的发生至关重要，这也为进一步的药理研究提供了基础。研究人员的研究结果扩展了有关G3BP2甲基化和稳定化对肿瘤进展的知识。高水平的PRMT5和USP7负责积累和加强G3BP2的去泛素化，这导致了脂肪生成和HNSC的侵略性恶性。PRMT5-USP7-G3BP2调节复合物是HNSC和其他脂质代谢疾病的潜在治疗策略。

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全文链接：https://www.nature.com/articles/s41419-023-05706-2

来源：老田讲科学