摘要：你是否曾惊叹于荧光显微镜下那些被点亮的生命图景？通过各种荧光染料或蛋白，我们得以窥见细胞的结构、蛋白的位置，仿佛给生命穿上了五彩的外衣。荧光显微镜无疑是现代生命科学的基石。

引言

你是否曾惊叹于荧光显微镜下那些被点亮的生命图景？通过各种荧光染料或蛋白，我们得以窥见细胞的结构、蛋白的位置，仿佛给生命穿上了五彩的外衣。荧光显微镜无疑是现代生命科学的基石。

然而，这层“外衣”有时也会带来烦恼。给分子打上荧光标签，就像给它们背上一个包裹，特别是对那些小分子而言，会不会改变它们原本的舞步？我们看到的是标签，而非分子本身。我们渴望一种更“裸眼”的方式，直接看清生命体内的分子，识别它们的化学身份，捕捉它们不被干扰的动态。

幸好，生命世界早已赋予每个分子最本质的“身份证明”——它们独特的化学键振动（chemical bond vibrations）。这些微小的振动，就像分子专属的“指纹”，蕴藏着关于其类型、状态和环境的丰富信息。原则上，捕捉这些振动就能揭示化学奥秘，且无需外部标记（label-free），也没有光漂白（photobleaching）的困扰。

但将这微弱的振动信号转化为清晰图像，曾是困扰研究人员的巨大难题。传统的拉曼显微镜信号太弱，中红外显微镜分辨率太低且受水干扰严重。

不过，现在，革命性的时刻到来了！基于相干拉曼散射（Coherent Raman Scattering, CRS）和振动光热/光声效应（Vibrational Photothermal/Photoacoustic, VIP）的先进振动显微镜（Advanced vibrational microscopes）克服了这些“看似无法逾越的障碍”！它们以前所未有的高速度、高灵敏度和不断突破的空间分辨率，让我们能直接“看清”活细胞和组织中特定化学键（specific chemical bonds）的存在与分布。（5月13日 《Nature Methods》 “Advanced vibrational microscopes for life science”）

分子“指纹”：振动是生命世界的独特语言

想象一下，每个分子都有自己独特的舞步——化学键的伸缩和弯曲振动。这些振动发生在特定的频率，就像每个人的指纹一样独一无二。

拉曼散射（Raman scattering）和红外吸收（infrared absorption）就是识别这些“指纹”的两种主要方式。简单来说，拉曼散射是光与分子振动相互作用后，散射光的频率发生微小变化，这个变化就对应着分子的振动频率。而红外吸收则是分子直接吸收特定频率的红外光，跃迁到更高的振动能级。

拉曼光谱的优势在于能够检测水分子的信号非常弱，非常适合水溶液环境中的生物样品。它的谱线也非常窄（约 1 nm），这意味着可以同时区分很多种分子，实现高度多重成像（highly multiplexed imaging），而且几乎没有光漂白（photobleaching）问题。相比之下，荧光的谱线较宽（约 50 nm），可用的荧光团数量有限，且容易发生光漂白。

然而，正如前面提到的，自发拉曼信号太弱，中红外吸收分辨率太低且受水干扰大，这些传统方法的局限性极大地限制了它们在生命科学中的应用，尤其是在需要高速、高灵敏度观察动态过程的场景。

点亮微弱信号：相干拉曼散射（CRS）的破局

为了解决信号微弱的问题，研究人员发展出了相干拉曼散射（CRS）显微技术，主要包括相干反斯托克斯拉曼散射（Coherent Anti-Stokes Raman Scattering, CARS）和受激拉曼散射（Stimulated Raman Scattering, SRS）。

CRS的基本原理是利用两束激光——泵浦光（pump）和斯托克斯光（Stokes），它们的频率差正好等于分子振动频率时，可以相干地驱动分子的振动，从而产生一个非常强的相干信号。CARS产生一个反斯托克斯信号，而SRS则是斯托克斯光的增强或泵浦光的减弱。

这项技术在速度和灵敏度上实现了巨大飞跃。通过将信号调制到MHz的高频，SRS显微镜（2008年首次报道）成功将信号从低频噪声中分离出来，实现了高灵敏度和高速生物医学成像。理论上，SRS与CARS具有同等水平的信噪比（SNR）。

为了进一步提升速度，研究人员发展了多种技术：

扫描速度：2005年，扫描式CARS实现了视频速率成像。2022年，宽场表面增强CARS更是达到了每秒120帧的成像速度。2016年， spatially multiplexed SRS 将帧率推高到2 kHz，实现了化学动力学的实时成像。

光谱获取速度：通过光谱聚焦（spectral focusing）或光谱多重（spectral multiplexing）技术，可以快速获取分子的完整振动谱。例如，2016年和2017年的研究利用快速可调谐激光实现了千赫兹甚至更高的光谱获取速度。

3D成像：结合Bessel光束或OCT技术，SRS实现了散射环境中两倍的成像深度（2017），并可以进行3D体积成像。

CRS技术不仅速度快，而且通过使用近红外（NIR）激光，可以最大程度地减少光损伤（photodamage）和非共振背景（nonresonant background）的影响。虽然非共振背景是CARS的一个问题，但研究人员也通过多种方法（如外差探测、相位匹配等）进行了有效抑制。

不止“看”分子：光热与光声的奇妙感知（VIP）

CRS是利用光与分子的相干振动相互作用，而振动光热/光声（VIP）显微镜则另辟蹊径，利用分子的振动吸收并转化为热的效应来成像。

VIP显微镜（比如中红外光热，MIP）采用“泵浦-探测”（pump-probe）方案。一束脉冲中红外光（泵浦光）被目标分子吸收，激发的振动能量在皮秒（picosecond）时间内迅速转化为热，导致局部温度升高。这种温度升高会引起样品微小的热膨胀，改变局部折射率（形成热透镜效应）。另一束可见光（探测光）穿过或散射通过这个区域时，其传播会受到影响，通过检测探测光的强度、相位或散射变化，就能间接感知到中红外光的吸收，从而获得化学对比度。

VIP的检测方式多样，可以基于散射、衍射、相位甚至荧光信号。特别是荧光检测的光热显微镜（F-MIP），利用一些对温度敏感的荧光探针，其荧光信号随温度的变化远高于散射信号的变化，灵敏度比基于散射的MIP提高了100倍（2021年报道），并且已实现了商业化。

除了光热效应，热量还会引起样品膨胀产生超声波，这就是振动光声（Vibrational Photoacoustic, VIPA）效应。通过探测这些超声波，可以实现振动成像。光声成像的优势在于超声波在组织中散射远小于光，因此非常适合深层组织成像，能够达到毫米级别的穿透深度。

VIP家族也在不断壮大：

受激拉曼光热（Stimulated Raman Photothermal, SRP）显微镜（2023年）结合了SRS的相干激发和光热检测，在光学澄清介质中比SRS更有效，且对激光噪声不敏感。

短波红外光热（Shortwave Infrared Photothermal, SWIP）和倍频光声（Overtone Photoacoustic, OPA）显微镜利用分子振动的倍频（overtone）吸收，这些吸收波长落在短波红外（SWIR, 1000-2500 nm）窗口（2024年、2013年报道）。SWIR窗口相比近红外和可见光有更低的散射，相比中红外有更低的水吸收，因此是实现深层组织化学成像的理想窗口，SWIP已经实现了毫米级深度和微米级分辨率的成像（2024年）。

在空间分辨率方面，扫描式MIP通过逆向传播几何（counter-propagating geometry）和高数值孔径物镜，实现了300 nm的空间分辨率（2017年）。宽场MIP结合干涉散射技术，能够以每秒635帧的速度对单个病毒进行指纹识别（2023年）。

突破极限：速度、分辨率与深度的大飞跃

先进振动显微镜的魅力在于它在速度、分辨率和深度上都取得了显著突破，极大地拓展了其应用范围。

在速度上，前面提到的视频速率扫描（如CARS的视频速率成像）、高速线扫描（如MIP的每秒超过2千条线）和宽场成像（如对单个病毒成像达到每秒635帧）都让捕捉生命体内的快速动态过程成为可能。

在空间分辨率上，虽然传统的拉曼和红外显微镜受衍射极限限制，但先进技术不断突破。例如，SRS结合STED技术实现了180 nm的横向分辨率（2021年）。利用光开关探针（photoswitchable probes），SRS实现了低于100 nm的光学分辨率（2023年）。MIP的逆向传播配置达到了300 nm的分辨率（2017年）。紫外光定位的MIPA更是将分辨率推至260 nm（2019年）。这些分辨率水平已经可以清晰地看到细胞器甚至纳米尺度的结构。

在穿透深度上，光声技术展现了独特优势。OPA和MIPA已经能够在生物组织中实现毫米级的深度成像。SWIP利用SWIR窗口，也实现了毫米级深度的振动成像。这对于研究组织结构和进行体内成像至关重要。

此外，结合层析成像技术（tomography），如MIP与OCT、强度衍射层析成像（IDT）或光学衍射层析成像（ODT）的结合，实现了厚组织、活细胞和蠕虫的3D化学分析和体积化学相位成像（2020年、2022年、2023年）。

从病毒到人体：化学成像的应用谱系

先进振动显微镜的应用已遍及生命科学的多个尺度，从微小的生物纳米颗粒到复杂的活体动物乃至人体皮肤。

生物纳米颗粒（20-300 nm）：SRS显微镜成功可视化了小鼠皮质脑片中炔基标记的聚合物纳米颗粒（2019年），MIP显微镜通过检测病毒蛋白质和核酸中的碱基，实现了单个病毒的指纹识别（2023年），无需标记就能区分不同的DNA和RNA病毒。这为药物递送和病毒学研究打开了新视角。

非病毒微生物（0.5-10 µm）：SRS成像被用于研究代谢工程大肠杆菌（E. coli）的脂肪酸链长和不饱和度（2023年）。MIP成像通过叠氮化物探针追踪了分支杆菌（mycobacteria）对海藻糖（trehalose）的摄取和膜定位（2024年）。这些对于理解微生物代谢、诊断感染性疾病和开发新抗生素至关重要。研究还表明，这些技术可以快速测定细菌对抗菌药物的敏感性（2020年，仅需不到2.5分钟），速度远超传统方法。

哺乳动物细胞（10-100 µm）：SRS成像被广泛用于研究细胞脂质代谢（2024年），例如揭示了iPS细胞神经元中脂质储存和动员的关键机制。MIP成像则对蛋白质聚集和脂质氧化具有高灵敏度，例如在阿尔茨海默病和帕金森病模型中，清晰成像了与神经退行性疾病相关的β-sheet结构（1628 cm⁻¹）和脂质氧化产物（1740 cm⁻¹）（2020年，2021年）。

模式生物（50 µm - 10 mm）：透明、易于遗传操作的秀丽隐杆线虫（C. elegans）是极好的模型。SRS定量绘制了线虫体内脂肪的分布、不饱和度和氧化状态（2014年）。CARS则揭示了肠道和表皮脂肪颗粒的多样性（2020年）。在几毫米大小的果蝇幼虫中，OPA成功成像了全身的脂质储存（2013年）。

组织切片（100 µm - 10 mm）：SRS组织学（Stimulated Raman Histology）通过对CH₃（蛋白质）和CH₂（脂质）信号成像，可以模拟苏木精-伊红（H&E）染色，用于快速术中脑肿瘤诊断。与传统诊断需约30分钟相比，基于卷积神经网络的快速诊断仅需不到2.5分钟（2020年）。MIPA在新鲜离体的小鼠胰腺组织中绘制了脂质（2850 cm⁻¹）和蛋白质（1550 cm⁻¹）分布图（2020年）。OPA则用于离体血管中的动脉粥样硬化检测（2007年）。

活体动物（5-20 cm）：SRS被用于监测小鼠坐骨神经中随肌萎缩侧索硬化（ALS）进展的脂质卵圆体沉积（2016年）。MIPA结合可见光光声，实现了对小鼠耳朵中血糖的无创监测（2024年），使用1080 cm⁻¹的红外光检测葡萄糖，532 nm可见光检测血管。

人体皮肤（1.5-1.8 m）：SRS成像捕捉了二甲亚砜（DMSO）在人体前臂皮肤的渗透过程（2010年，2017年）。MIP显微镜通过相位梯度直流（DC）成像，可视化了人体皮肤内源性脂质和苯甲酰过氧化物（药物）的分布（2024年）。

这些丰富的应用案例证明，先进振动显微镜能够提供化学键特异性、亚微米空间分辨率和高达视频速率的速度，在不同尺度的生命系统研究中展现出巨大潜力。

解码海量数据与未来展望

先进振动显微镜产生的数据量巨大，特别是高光谱成像数据（空间维度与光谱维度的结合）。这催生了数据科学在化学成像中的重要作用。从传统的光谱解混（spectral unmixing）到各种机器学习（machine learning）方法（包括深度学习），数据科学正帮助科学家从海量数据中提取有意义的化学信息，甚至用于辅助诊断，突破仪器的物理限制。例如，卷积神经网络（CNN）已经被用于辅助快速病理诊断。

尽管取得了巨大进展，先进振动显微镜仍面临挑战。与荧光显微镜相比，其检测灵敏度仍有差距，通常需要毫摩尔（mM）级别的分子浓度才能实现快速成像，而荧光可以轻松达到纳摩尔（nM）甚至单分子水平。实现微摩尔（μM）到纳摩尔灵敏度是振动纳米显微镜发展的关键目标。

为了提高灵敏度和特异性，研究人员正积极开发各种振动探针（vibrational probes），比如稳定的同位素标记（如C-D键），以及含三键的小分子探针（如叠氮化物azide、炔基alkyne和腈nitrile）。这些探针在生物“静默窗口”区域（生物分子天然振动信号较弱的区域）有信号，能显著提高特异性。其中，叠氮化物适合中红外成像，炔基适合拉曼成像，腈则两种都适用。结合这些探针，有望实现对低浓度药物分子、特定细胞器等的成像。

未来的发展方向包括：进一步提高灵敏度，实现单分子级别的振动成像；开发更多具有变革性、超出荧光显微镜能力的创新应用，例如无标记地绘制碳水化合物、氨基酸或蛋白质的分布，成像低浓度药物分子在细胞内的定位和代谢。降低设备成本也是推广的关键，快速可调谐的光纤激光器有望解决这一瓶颈。

目前，一些先进的CRS（如Leica, Invenio等）和MIP（如mIRage）显微镜已经实现商业化，在全球范围内的实验室中得到了应用。学术界与产业界的共同努力，将推动非线性振动显微镜更广泛地普及和应用。

从范·列文虎克的单镜片显微镜到如今的先进振动显微镜，光学显微技术不断革新着我们对生命的认知。先进振动显微镜作为连接相位差显微镜和荧光显微镜的新兴力量，它凭借其独特的化学键特异性、不断提升的速度、分辨率和穿透深度，以及无需标记的优势，正为我们揭示生命体更深层次的化学和功能信息。

它不仅是实验室里探索分子机制的利器，也日益展现出在临床诊断和药物开发等领域的巨大潜力。虽然挑战依然存在，但先进振动显微镜的光明前景无疑令人兴奋。它正成为生命科学研究中一双不可或缺的“慧眼”，帮助我们以全新的视角，解码生命的奥秘。

参考文献

Cheng JX, Yuan Y, Ni H, Ao J, Xia Q, Bolarinho R, Ge X. Advanced vibrational microscopes for life science. Nat Methods. 2025 May;22(5):912-927. doi: 10.1038/s41592-025-02655-w. Epub 2025 May 13. PMID: 40360912.

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来源：生物探索一点号1