摘要：近年来，化疗与铜死亡（Cuproptosis）联合应用因其独特的协同抗肿瘤效应而在肿瘤治疗中展现出卓越的临床潜力。化疗通过抑制肿瘤细胞增殖、干扰DNA复制及诱导细胞凋亡，有效阻滞肿瘤进展。与此同时，部分化疗药物可显著提高肿瘤细胞内的氧化应激水平，为铜死亡的发生

近年来，化疗与铜死亡（Cuproptosis）联合应用因其独特的协同抗肿瘤效应而在肿瘤治疗中展现出卓越的临床潜力。化疗通过抑制肿瘤细胞增殖、干扰DNA复制及诱导细胞凋亡，有效阻滞肿瘤进展。与此同时，部分化疗药物可显著提高肿瘤细胞内的氧化应激水平，为铜死亡的发生提供更有利的微环境，从而增强其细胞毒性效应。

成都中医药大学鲁军教授（点击查看介绍）课题组围绕诱导铜死亡效应的还原敏感型纳米药物的构建，发展了Combretastatin A-4（CA-4）二聚体与Elesclomol-Cu（ii）联合应用的GSH响应型CA-4S2@ES-Cu纳米药物体系。

Mechanistic illustration of the CA-4S2@ES-Cu for synergistic cascade therapy against HCC

一、诱导铜死亡效应还原敏感型纳米药物的构建

围绕诱导铜死亡效应的还原敏感型纳米药物的构建，作者设计并制备了CA-4S2@ES-Cu和CA-4C6@ES-Cu两种纳米药物体系。首先，通过纳米共沉淀法成功制备出上述两种纳米药物，并利用多种表征技术系统评价了其理化性质。紫外-可见光谱（UV-Vis）、红外光谱（FTIR）和X射线光电子能谱（XPS）等结果表明，ES-Cu与CA-4二聚体成功包封于纳米体系中，并具有良好的结构完整性。动态光散射（DLS）和透射电子显微镜（TEM）的结果进一步证实，两种纳米药物均表现出合适的粒径分布和稳定的球形结构。CA-4S2@ES-Cu 纳米体系的载药量和包封率明显优于CA-4C6@ES-Cu，两种纳米药物体系在不同生理模拟环境（PBS、胎牛血清及大鼠血浆/肝素）中均表现出良好的稳定性，在模拟肿瘤微环境的谷胱甘肽（GSH）响应性释放研究中发现，CA-4S2@ES-Cu 对GSH表现出明显的响应特性，在高浓度 GSH 条件下（1 mM、5 mM、10 mM）24 h 内药物释放量均超过 70%，而在无 GSH 条件下药物释放极少，显示出优异的肿瘤微环境选择性释放效果。与之相比，CA-4C6@ES-Cu 在不同浓度的GSH环境下均缺乏明显响应，进一步突出了 CA-4S2 中二硫键的关键作用 (图1)。

图1. Preparation and characterization of CA-4S2@ES-Cu and CA-4C6@ES-Cu. (A) Schematic diagram of the preparation for CA-4S2@ES-Cu and CA-4C6@ES-Cu. (B) Representative TEM images of CA-4S2@ES-Cu and CA-4C6@ES-Cu. (C) Representative element maps (Cu, O, N, and S) of CA-4S2@ES-Cu and CA-4C6@ES-Cu. Scale bar 200 nm. ES formula: C19H20N4O2S2, CA-4S2 formula: C42H46O12S2, CA-4C6 formula: C44H50O12. (D, E) The hydrodynamic size distribution and zeta potentials of CA-4S2@ES-Cu and CA-4C6@ES-Cu (in ultrapure water) (n = 3). (F) FTIR spectra of ES, ES-Cu, CA-4S2, CA-4C6, CA-4S2@ES-Cu and CA-4C6@ES-Cu. (G) XPS analysis of CA-4S2@ES-Cu and CA-4C6@ES-Cu. (H) High-resolution N 1s XPS spectra of CA-4S2@ES-Cu and CA-4C6@ES-Cu. (I) The appearance of CA-4S2@ES-Cu and CA-4C6@ES-Cu (0.5 mg/mL) stored at 4 °C for 15 d.

二、CA-4S2@ES-Cu会加重氧化应激并诱发铜死亡效应

作者通过多种细胞实验方法评估了CA-4S2@ES-Cu纳米药物的体外抗肿瘤活性。研究发现，该纳米药物能够有效抑制肝癌细胞增殖和克隆形成能力，并显著影响细胞周期进程，诱导肝癌细胞G2/M期阻滞。此外，其通过增加细胞内铜离子浓度与ROS生成量，明显增强了氧化应激，诱发线粒体功能障碍，干扰细胞三羧酸（TCA）循环，诱导蛋白质毒性应激，促进细胞凋亡与铜死亡。同时，由线粒体功能障碍导致的氧化应激和GSH的消耗打破了细胞氧化还原稳态，进一步放大了铜死亡效应。这些结果明确了CA-4S2@ES-Cu具有强效的体外抗肿瘤效应，并揭示了其机制基础 (图2)。

图2. CA-4S2@ES-Cu induced cuproptosis in HCC cells. (A) Schematic mechanism of CA-4S2@ES-Cu induced cuproptosis in HCC cells. (B) Copper ion concentrations in HCC cells after various drug treatments. (C) Cuprous ion levels in HCC cells after treatment with different drugs (D) DLAT oligomerization in HCC cells after various drug treatments in confocal microscopy images, scale bar: 10 μm. (E) GSH levels after different drug treatments in HCC cells. (F, G) Western blot analysis of variations in FDX1 and DLAT expression in HCC cells after different drug treatments. (H, I) ROS levels in HCC cells after different drug treatments. (J, K) Representative confocal microscopy images of mitochondrial membrane potential levels in HCC cells after different drug treatments, scale bar: 30 μm. * p p p

三、CA-4S2@ES-Cu可诱发ICD效应

CA-4S2@ES-Cu处理HCC细胞后，大量ATP被释放到细胞外环境中。此外，免疫荧光结果显示，CA-4S2@ES-Cu能显著促进大量CRT暴露，释放刺激信号。同时，CA-4S2@ES-Cu处理后，HCC细胞核中HMGB1的荧光明显下降。DAMPs的释放会吸引DCs向肿瘤区域迁移，促进它们摄取和呈现肿瘤抗原，从而启动T细胞介导的抗肿瘤免疫反应。经流式细胞术检测，CA-4S2@ES-Cu组治疗的肿瘤组织中成熟DC（CD80+，CD86+）的比例明显高于对照组和其他药物治疗组。总之，CA-4S2@ES-Cu能启动DAMPs的释放，激活ICD，增强抗肿瘤免疫应答，而且首次发现CA-4二聚体具有诱导ICD的活性（图3）。

图3. CA-4S2@ES-Cu stimulated ICD. (A) Schematic diagram of the mechanism for stimulating ICD by CA-4S2@ES-Cu (B, C) Release levels of ATP in HCC cells after treatment with various drugs. (D, E) Representative confocal microscopy images of CRT exposure after various drug treatments of HCC cells, scale bar: 10 μm. (F, G) Representative confocal microscopy images of HMGB1 release in HCC cells after various drug treatments, scale bar: 10 μm. (H) Quantitative analysis of HMGB1 fluorescence intensity. (I, J) Proportion of mature DCs measured by flow assay in HCC tissues after various drug treatments. * p p p

四、CA-4S2@ES-Cu体内抗肿瘤疗效

作者建立了同种异体移植肿瘤模型，以评估 CA-4S2@ES-Cu 的体内抗肿瘤效果，其中CA-4S2@ES-Cu组的肿瘤抑制效果最为显著，肿瘤生长抑制率高达95%。H&E染色显示，与对照组相比，CA-4S2@ES-Cu肿瘤内的组织破坏非常明显。同时，通过Ki67免疫组化检测，CA-4S2@ES-Cu能有效抑制肿瘤组织的增殖。通过检测小鼠肿瘤组织中的DLAT寡聚化，CA-4S2@ES-Cu组的DLAT聚集状态最为强烈，这表明它能有效诱导体内铜死亡效应。此外，CA-4S2@ES-Cu显著抑制了在肿瘤侵袭和转移中起关键作用的MMP-14和VEGFA的表达，表明其具有抑制肿瘤转移的潜力。通过免疫荧光评估肿瘤组织中CD4/CD8的表达，CA-4S2@ES-Cu治疗组的红绿荧光最多、最强。以上结果表明CA-4S2@ES-Cu 能铜死亡并引发免疫反应，从而显著抑制体内肿瘤的生长（图4）。

图4. Antitumor effects of CA-4S2@ES-Cu in a subcutaneous HCC model. (A) Illustration for development of HCC tumor models and treatment programs. (B) Representative images of tumor tissues from different treatment groups. (C) Variation in tumor volume during the treatment period. (D) Tumor weight after 14 days of treatment. (E) Representative H&E staining images of tumor tissues and immunohistochemical staining for Ki67, DLAT, MMP-14 and VEGFA. (F) Representative immunofluorescence images of CD4/CD8 in tumor tissues. * p p p

小结

本研究提出了一种新型治疗肝细胞癌（HCC）的策略，构建了CA-4S2@ES-Cu纳米药物，通过增强铜死亡效应协同提升化疗与免疫治疗效果。在肿瘤细胞高GSH环境下，药物释放CA-4和ES-Cu，CA-4抑制微管聚合、阻断有丝分裂、降低HIF-1α表达、抑制血管生成并诱导ROS生成；ES-Cu在FDX1作用下释放Cu⁺，诱导DLAT聚集，引发线粒体紊乱与强氧化应激。GSH消耗进一步增强铜死亡。两者协同诱导DAMPs释放，激活T细胞免疫反应，逆转免疫抑制环境。本研究融合化疗、免疫治疗与铜死亡，为HCC治疗提供了可工业化的新方案，但仍需优化工艺参数及建立质量控制标准。

该成果由成都中医药大学药学院鲁军教授/何瑶教授团队、成都中医药大学附属医院张传涛教授团队共同合作完成，成都中医药大学药学院硕士研究生曾英杰、曹悦宁、任森淼等为共同一作。该研究得到了国家自然科学基金委员会和四川省科技厅的资助。

Responsive ROS-Augmented Prodrug Hybridization Nanoassemblies for Multidimensionally Synergitic Treatment of Hepatocellular Carcinoma in Cascade Assaults

Yingjie Zeng, Yuening Cao, Senmiao Ren, Chaozheng Zhang, Jianan Liu, Ke Liu, Yan Wang, Hongyu Chen, Fengjiao Zhou, Xiuli Yang, Xian Ge, Tingting Zhang, Tianbao Wang, Yao He, Defang Li, Chuantao Zhang, Jun Lu

Adv. Sci. 2025, DOI: 10.1002/advs.202501420

导师介绍

鲁军

来源：X一MOL资讯