肝细胞Hedgehog信号通路抑制通过促进衰老加速MASLD疾病进程

摘要：MASLD相关肝硬化和其他代谢功能障碍性疾病发生风险随年龄增长而增加。主要原因是，随年龄增长而累积的表观遗传修饰使细胞难以再生，并引发衰老相关分泌表型。MASLD可诱导肝细胞DNA损伤和衰老，其严重程度和衰老肝细胞的数量密切相关。然而，肝细胞衰老的原因及其加剧

【导语】

MASLD相关肝硬化和其他代谢功能障碍性疾病发生风险随年龄增长而增加。主要原因是，随年龄增长而累积的表观遗传修饰使细胞难以再生，并引发衰老相关分泌表型。MASLD可诱导肝细胞DNA损伤和衰老，其严重程度和衰老肝细胞的数量密切相关。然而，肝细胞衰老的原因及其加剧MASLD的具体机制，目前尚不完全清楚。

Hedgehog信号通路具有抑制细胞衰老、促进长寿的作用，它在生长、再生及癌细胞中均表现出激活状态。近期也有研究表明在肝切除模型中，抑制肝细胞中的Smo（Hedgehog通路的关键调控基因），可促进肝细胞衰老。然而，Smo在MASLD中的作用尚不清楚。

今天特别推荐发表于J Clin Invest（IF=13.3）的一项基础研究“The senescence-associated secretome of hedgehog-deficient hepatocytes drives MASLD progression”，该研究从细胞衰老的角度解析了Hedgehog信号通路抑制如何加速MASLD疾病进程。

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· 结果 ·

Results

1. 肝细胞特异性敲除Smo加速MASLD发展

12周龄Smoflox/flox小鼠经6周CDAHFD饮食喂养，并在最后一周通过尾静脉注射AAV-TBG-Cre（n=9，Smo KO组）或AAV-TBG-Luci（n=10，对照组）以特异性敲除肝细胞中的Smo（图1A）。结果显示，肝细胞中Smo的敲除降低了CDAHFD小鼠的Gli2核积累，同时加重了肝脏炎症（F480）、纤维化（α-SMA、Col1、Vimentin、Desmin）并增加了衰老相关基因的表达（p21、p16、β-gal）（图1B-D）。

此外，rH2AX和8-羟基脱氧鸟苷（8OHDG）在细胞核中表达增加，反映Smo敲除导致的DNA损伤加剧。Hedgehog信号通路的破坏还加剧了肝脏脂毒性，表现为油红染色、TUNEL染色及脂质过氧化标志物（如MDA、4HNE）的增加（图1E-G）。对Smo KO小鼠（n=4）和对照组小鼠（n=4）肝组织的RNA测序及基因集富集分析（GSEA）显示，Smo KO肝脏中与脂肪生成和脂肪酸代谢相关的基因上调，而与胆固醇稳态相关的基因下调。

与对照组相比，Smo KO小鼠的血清胰岛素水平和HOMA-IR显著升高，表明肝细胞Smo的缺失促进了胰岛素抵抗。综上所述，破坏Hedgehog信号通路可增加脂毒性、加速衰老、促进肝细胞炎症和纤维化反应，进而导致MASLD的发展。

图1

2. 肝细胞Smo特异性敲除导致抗氧化反应下降

12周 C57BL/6J Smoflox/flox小鼠，注射AAV8-TBG-Luci（对照）或AAV8-TBG-Cre（Smo KO）以特异性敲除肝细胞Smo。喂养普通饮食，并在尾静脉注射病毒后一周处死，提原代肝细胞和条件培养基。利用Proteome Profiler Mouse Cytokine Array分析正常饮食Smo-KO及对照小鼠血清和肝细胞条件培养基中的分泌组。Smo KO组较对照组在血清和/或条件培养基中多种细胞因子显著升高，Smo-KO组胸苷磷酸化酶（Thymidine phosphorylase，TP）蛋白水平显著低于对照组（图2A-B）。

TP具有促血管生成、改善线粒体健康、减轻氧化应激及抑制衰老的作用，编码基因是TYMP。WB结果表明，正常饮食或者CDAHFD饮食中，Smo KO小鼠肝脏TP表达均下降（图2C）。

免疫组化表明，TP定位于细胞质和细胞核，并且在Smo KO小鼠中表达均下降（图2D）。Elisa结果表明，KO鼠中血清TP的含量低于对照组（图2E），随肝纤维化分期增高，TP、Nrf2、HO1表达降低（图2. G-J）。综上所述，肝细胞特异性敲除Smo，其分泌组缺乏抗氧化防御因子。

图2

3. 肝细胞Smo特异性敲除TP、Nrf2和HO1降低导致线粒体适应性受损

肝细胞Smo特异性敲除降低Nrf2和HO1表达，且Smo、TP、Nrf2、HO1存在相互作用（图3A-C）。从CDAHFD喂养的Smo-KO和对照小鼠的肝脏中分离线粒体，并对TP、Smo、Nrf2、HO1、OXPHOS成分和其他线粒体标志物进行WB。敲除Smo可降低TP和HO1的线粒体积累，并显著下调OXPHOS复合物2、3和5以及线粒体标记物（图3D）；PGC1a是Nrf2的靶基因且与线粒体功能密切相关，显著降低（图3E）。

Smo-KO组线粒体凋亡诱导因子（AIF）和第二线粒体衍生caspase激活因子（Smac）的水平较低，但这些蛋白在细胞质水平较高，这与线粒体膜通透性增加相关（图3F）。综上所述，肝细胞特异性敲除Smo可导致线粒体功能受损。

图3

4. TP蛋白保护肝细胞免受衰老诱导剂引发的脂肪毒性和衰老

使用细胞周期蛋白依赖性激酶CDK4和CDK6抑制剂处理AML-12细胞5天，以诱导衰老，然后在培养基中添加重组TP蛋白或对照溶剂48小时（图4A）。TP重组蛋白可以逆转衰老诱导剂（脂毒性、衰老）的作用（图4B-C）。

图4

5. 补充TP可恢复线粒体健康

为验证TP治疗Smo KO肝细胞是否能保护其免受脂肪毒性，分离对照小鼠和Smo KO小鼠原代肝细胞，加PA和TP重组蛋白（图5A）。TP可缓解PA导致的脂毒性，改善线粒体功能（图5B-F）。Huh7细胞使用siRNA干扰Smo，加PA、TP蛋白，同样发现，Smo可以改善衰老，促进线粒体健康（图5G）。