bioRxiv | 通过调控GRF4-GIF1表达实现小麦跨品种的高效、基因型非依赖性遗传转化

摘要：小麦作为全球最重要的粮食作物之一，其持续的遗传改良对于保障世界粮食安全至关重要。然而，长期以来，小麦的功能基因组学研究和分子育种进程一直受限于一个核心技术瓶颈——遗传转化。传统的小麦转化方法效率低下，且具有严重的“基因型依赖性”，即仅对少数几个实验室“模式”品

小麦作为全球最重要的粮食作物之一，其持续的遗传改良对于保障世界粮食安全至关重要。然而，长期以来，小麦的功能基因组学研究和分子育种进程一直受限于一个核心技术瓶颈——遗传转化。传统的小麦转化方法效率低下，且具有严重的“基因型依赖性”，即仅对少数几个实验室“模式”品种（如Fielder）有效，而对绝大多数具有重要育种价值的商业栽培品种则收效甚微甚至完全无效。近年来，生长调节因子（GRF）与其互作因子（GIF）的融合蛋白技术，特别是GRF4-GIF1，被证明能够显著提升植物的再生能力，为打破小麦转化的基因型壁垒带来了希望。然而，组成型（持续高水平）表达这类强大的发育调控因子，往往会带来不期望的副作用（多效性），如植株发育异常、育性降低等，这限制了其在实际育种中的应用。因此，如何巧妙地利用GRF4-GIF1的强大再生促进能力，同时又能规避其潜在的负面影响，是推动小麦遗传转化技术实现革命性突破的关键。

英国约翰·英纳斯中心（John Innes Centre）的Sadiye Hayta团队在预印本平台bioRxiv上发表题为“Controlling GRF4-GIF1 Expression for Efficient, Genotype-Independent Transformation Across Wheat Cultivars”的论文，开发并优化了一套基于GRF4-GIF1融合基因的、高效且稳健的根癌农杆菌介导的小麦遗传转化体系。该研究不仅成功将转化技术拓展至多个此前被认为是“顽固型”的小麦栽培品种，更重要的是，通过引入组织特异性启动子和诱导型基因切除系统，巧妙地解决了GRF4-GIF1过表达带来的多效性问题，为小麦的功能基因组研究和精准育种提供了一个通用、高效且安全的平台。

GRF4-GIF1技术打破多倍体小麦的转化壁垒

研究团队首先在9个六倍体普通小麦品种和多个四倍体硬粒小麦品种中，系统性地测试了由强启动子（玉米泛素启动子ZmUbi）驱动的GRF4-GIF1融合基因对转化效率的影响。结果令人振奋：在所有测试的品种中，GRF4-GIF1的引入均显著提升了愈伤组织的再生能力和最终的转化效率（图1）。在模式品种Fielder中，转化效率飙升至77.5%；在英国重要品种Cadenza中，效率达到60%；即便是国际育种中广泛应用的Borlaug 100，效率也达到了40%。更重要的是，该技术成功攻克了多个被传统方法视为极难转化的冬小麦品种（如Skyfall和Valoris），实现了16-20%的转化效率（图2）。同样，在四倍体硬粒小麦中，该技术也表现出色，在意大利品种Svevo中效率高达55%。这一系列结果有力地证明，GRF4-GIF1技术能够有效克服小麦转化的基因型依赖性，将遗传操作的范围从少数模式品种拓展到广泛的优良栽培种。然而，研究也发现，高拷贝数的GRF4-GIF1转基因植株会表现出不同程度的育性下降，特别是对某些品种（如Kronos）影响较大，这凸显了精细调控其表达的必要性（图3）。

策略一：利用组织特异性启动子规避多效性

为了解决组成型表达GRF4-GIF1带来的负面影响，研究团队提出了一种精巧的解决方案：使用组织特异性启动子。他们将驱动GRF4-GIF1的ZmUbi启动子替换为玉米磷脂转移蛋白基因的启动子（ZmPLTP）。该启动子的特点是，它主要在转化的早期阶段，即胚性愈伤组织中高水平表达，而在发育成熟的植株的大部分组织中表达水平很低。实验结果完美验证了这一设计思路：在ZmPLTP启动子的驱动下，GRF4-GIF1既能在关键的再生阶段发挥强大作用，保证了较高的转化效率（在Fielder中为20%，在Kronos中为23%），又能在植株的后续生长发育中“沉默”，从而极大地减轻了不良表型。使用该系统的转基因植株，其分蘖数、开花时间和育性均接近于非转基因对照，表现出正常的生长发育（图4）。

策略二：热诱导Cre/lox系统实现基因“阅后即焚”

作为另一种解决方案，研究团队引入了热诱导的Cre/lox基因切除系统，实现了对GRF4-GIF1表达框的“用后即删”。在该系统中，GRF4-GIF1基因两侧被loxP位点包围，同时载体上含有一个由热激启动子（HvHsp17）控制的Cre重组酶基因。在愈伤组织再生出苗后，通过一次简单的热处理（40°C过夜），即可诱导Cre酶的表达，从而精准地切除GRF4-GIF1基因片段。这种“一键删除”策略在Kronos品种中实现了高达73%的切除效率。成功切除GRF4-GIF1的植株，其过度分蘖等不良表型得到显著缓解，育性也恢复正常。这一“阅后即焚”的策略为获得“干净”、无发育调控基因残留的转基因或基因编辑植株提供了一条高效途径。

性能比较与应用拓展

为了进一步评估GRF4-GIF1系统的优势，研究团队将其与另一个报道能提高小麦转化效率的形态发生基因WOX5进行了比较。结果显示，虽然WOX5也能提高转化效率，但其转基因植株表现出更严重的生长缺陷，如植株矮小、籽粒变大、叶片螺旋状生长等（图5）。相比之下，经过优化的GRF4-GIF1系统在实现高转化效率的同时，能更好地维持植株的正常发育。此外，研究还成功验证了共转化（Co-transformation）策略的可行性，即通过两个独立的农杆菌菌株，一个携带GRF4-GIF1，另一个携带目标基因，可以实现同样高的转化效率。这种方法不仅灵活方便，而且在后代中可以通过遗传分离，轻松去除GRF4-GIF1，为实际育种应用提供了极大的便利。

本研究通过对GRF4-GIF1技术的系统性优化和多品种验证，成功建立了一套高效、稳定且基本不受基因型限制的小麦遗传转化新范式。该研究的核心贡献在于，不仅证实了GRF4-GIF1在打破小麦转化壁垒方面的巨大潜力，更通过引入组织特异性表达和诱导型基因切除等精细调控策略，巧妙地解决了该技术可能带来的多效性副作用，使其真正成为一项安全、实用的工具。这项工作极大地拓宽了可进行遗传操作的小麦品种范围，将基因编辑等前沿技术从少数模式品种解放出来，使其能够直接应用于世界各地的优良商业品种。这无疑将极大地加速小麦功能基因组学的研究进程，并为基于精准设计的作物改良铺平道路，对提升作物抗逆性、营养价值和生产力具有深远的意义。

本文第一作者及通讯作者为英国约翰·英纳斯中心（John Innes Centre）的Sadiye Hayta。该研究得到了英国生物技术与生物科学研究理事会（BBSRC）和土耳其科学技术研究理事会（TUBITAK）等机构的资助。

DOI链接：https://doi.org/10.1101/2025.08.29.673042