摘要：近日,Plant Biotechnology JouRNAl在线发表了由河北农业大学段会军课题组联合北京格致博雅生物科技有限公司，中国科学院遗传与发育生物学研究所撰写的“Single-cell transcriptomic profiling of maize

近日, Plant Biotechnology JouRNAl在线发表了由河北农业大学段会军课题组联合北京格致博雅生物科技有限公司，中国科学院遗传与发育生物学研究所撰写的“Single-cell transcriptomic profiling of maize cell heterogeneity and systemic immune responses against Puccinia polysora Underw”论文，该研究基于单细胞转录测序技术（single cell RNA sequencing, scRNA-seq），首次构建了多堆柄锈菌（P. polysora）感染的玉米叶片单细胞图谱。通过分析抗病自交系R99与易感自交系N110在真菌感染后的细胞类型特异性免疫应答差异，揭示了保卫细胞和表皮细胞的免疫激活状态对于R99抗病性的重要贡献。进一步，研究团队鉴定到抗玉米南方锈病的关键基因——ZmCHit7，该基因存在一个SNP（G401T），可以区分抗性与易感。本研究为培育抗南方锈病的玉米新品种提供了宝贵的理论依据。

玉米是全球最重要的粮食作物和饲料作物，对全球粮食安全至关重要。然而，其生产目前受到多种病虫害的威胁，特别是由Puccinia polysora引起的南方玉米锈病，这种病害严重时可能导致产量损失高达50%甚至完全绝收。目前，我们对玉米锈病抗性的分子机制和关键基因了解不足，且传统育种方法难以培育出优良抗病品种。本研究利用高分辨率单细胞RNA-seq技术（scRNA-seq），首次构建了感染P. polysora的玉米叶片组织的单细胞转录组图谱，同时识别了参与病原体响应的具体细胞类型，并描绘了免疫、过渡和易感状态。通过拟时序分析，描绘了从免疫到高度易感的病害进展过程，深入解析了抗病途径及其调控基因。值得注意的是，在感染的玉米叶片中，几丁质合成酶基因ZmCHit7丰度显著增加。这些基于感染图谱确定的功能标记有助于玉米抗病分子标记辅助育种，进一步优化抗病育种策略。全文研究结果如下：

1.Puccinia polysora感染下的R99和N110的单细胞转录组图谱

为了理解玉米与真菌病害之间的相互作用，研究者首先比较了在接种Puccinia polysora前后，玉米品种R99和N110的表型差异。结果显示，在接种P. polysora后，两个品种的表型存在显著差异：R99对感染类型IT 1具有抗性，而N110则对IT 7-9敏感（图1a）。此外，在接种后4天，R99幼苗中的菌丝生长显著减少且表现出抗性表型，N110在P. polysora感染的所有阶段都更为敏感（图1）。

图1：在P. polysora感染下，R99和N110的叶片单细胞转录组景观

为了阐明两个品种在P. polysora感染下导致表型差异的深层分子机制，研究者构建了R99和N110在模拟感染和真菌感染条件下，接种后12小时的叶片单细胞图谱（图2a）。共获得了70,803个高质量单细胞数据，确定了17个主要细胞簇（图2c），包含六大类细胞类型，并捕获了R99和N110在P. polysora感染下动态基因表达的变化。

图2：基于scRNA-seq鉴定的玉米叶片细胞类型

2. 在R99和N110中，P. polysora感染下特定细胞类型的转录变化

研究者发现当被P. polysora感染时，不同细胞类型的差异表达基因数量有所不同。这种异质性可能反映了细胞类型对病原体感染的不同反应模式。与N110相比，在抗性自交系R99中，P. polysora感染下的DEGs数量显著减少：在N110（感染组 vs. 未感染）中共发现了5882个DEGs；在R99（感染组 vs. 未感染）中共鉴定出2057个DEGs。这表明感染对R99基因表达的影响出现了系统性减弱（图3a）。

研究者进一步关注了N110和R99中共性关键抗性基因：感染前后，两个玉米品种之间有1301个共有DEGs，其中761个在特定细胞类型中共同上调，540个在特定细胞类型中共同下调（图3c），并通过GO和KEGG通路富集分析进一步明确共有差异表达基因的相关功能。研究者分别在R99和N110中鉴定了14个和15个在SCR感染后被诱导的NLR基因，并通过VIGS验证了对玉米南方锈病抗性具有正向贡献的2个NLR基因。

图3：R99和N110在P. polysora感染下的细胞类型特异性差异表达基因

3. R99 的保卫细胞对 P. polysora 感染具有抗性

研究者基于感染和未感染的R99和N110细胞进行拟时序分析，旨在重建各类细胞在感染前后的基因表达轨迹。对于N110易感自交系而言，未感染的保卫细胞沿着拟时间轨迹（右端→左端）逐渐转变为感染细胞（图4a）。R99自交系的保卫细胞即使在未感染条件下，也聚集在轨迹的左端，这表明R99在未感染时就提前激活了免疫状态。与N110相比，R99在未感染时有多个免疫应答基因高表达（图4b,c）且与多种应激反应途径相关：包含植物激素信号传导途径、抗病性等（图4d）。这些基因在保卫细胞中的表达随着拟时间轨迹向左而逐渐增加，这表明感染部位的细胞逐渐被诱导（图4e）。先前的研究已经证明NBS-LRR基因在植物的抗病性中发挥重要作用，RPM1（属于NBS-LRR基因）在R99的保卫细胞中也显著上调。R99的保卫细胞维持高水平的PTI和ETI，这可能是其固有免疫应答的一部分。

图4：R99的保卫细胞对P. polysora感染具有抗性

4. R99的表皮细胞有助于抵抗P. polysora感染

表皮细胞是植物抵抗病害的第一道防线，参与了植物的固有免疫（PTI）应答。对P. polysora感染后的玉米表皮细胞进行了拟时序分析。R99的表皮细胞在未感染时就高度表达了由P. polysora感染诱导的基因，表明其处于预先激活的防御状态（图5a）。对拟时间轨迹中表达显著变化的基因（前500个基因）进行聚类分析，表现出两种截然不同的表达模式：一种与表皮细胞的正常生理功能相关，另一种与应激反应和营养利用相关（图5b）。R99中与抗性相关的差异表达基因的表达水平高于易感品种N110（图5c）。在抗病自交系R99中，保卫细胞和表皮细胞中都处于预先激活的免疫状态，并发现了23个在这两种细胞类型中共同激活的基因，包括与生物胁迫抗性的相关的AP2转录因子。

图5：R99的表皮细胞对P. polysora感染具有抗性

5. 真菌诱导的几丁质合成酶基因ZmCHit7R99增强了玉米叶片对P. polysora的抗性

图6：通过稳定转化、单倍型分析及表型试验验证ZmCHit7功能

南方玉米锈病（SCR）对全球玉米产量构成严重威胁。本研究通过单细胞测序技术成功鉴定出SCR关键抗性基因——ZmCHit7。该基因可用于区分抗病系和易感系，在玉米抗锈病育种中具有良好应用前景。

河北农业大学农学院副教授闫晓翠，生命学院副教授刘青，农学院博士生杨倩和北京格致博雅生物王开来为本论文共同第一作者。河北农业大学农学院段会军教授，中科院遗传所李淼淼副研究员和北京格致博雅生物技术总监邓淑翰为共同通讯作者。

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来源：科学论