摘要：今天推荐的是由厦门大学医学院癌症研究中心在2023年1月27日发表于Cell Death and Disease（2021IF：9.6963，JCRQ1）的一篇文章，通讯作者是Gang Song教授，研究表明USP39通过去泛素化稳定β-catenin并抑制E

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今天推荐的是由厦门大学医学院癌症研究中心在2023年1月27日发表于Cell Death and Disease（2021IF：9.6963，JCRQ1）的一篇文章，通讯作者是Gang Song教授，研究表明USP39通过去泛素化稳定β-catenin并抑制E3连接酶TRIM26 mRNA前体的成熟，促进HCC的进展。

研究背景

泛素特异性蛋白酶39（USP39）作为保守的去泛素化家族的成员，在调节mRNA前体剪接和泛素-蛋白酶体依赖性蛋白分解中发挥着重要作用。越来越多的证据证明，USP39参与了肝细胞癌（HCC）的发展。然而，人们对USP39调节肝细胞癌（HCC）生长的机制尤其是去泛素化目标知之甚少。

摘要部分

在这里，研究人员证明USP39通过直接去泛素化β-catenin来促进HCC细胞的增殖和迁移，β-catenin是Wnt/β-catenin信号通路的一个关键分子，它的异常表达或激活会导致一些肿瘤的发生，在与USP39共定位之后。在这个过程中，E3连接酶TRIM26的表达呈现出下降的趋势，在研究人员以前的研究中，它被证明可以抑制HCC。研究人员进一步证明，TRIM26 mRNA前体剪接和成熟受到USP39的抑制，同时伴随着其泛素化β-catenin的减少，间接促进HCC的进展。综上所述，研究人员的数据揭示了HCC进展中的一个新机制，即USP39通过直接去泛素化和减少TRIM26 mRNA前体成熟和剪接两种方式提高β-catenin水平，促进HCC的增殖和迁移，这可能为HCC的临床治疗提供一个新的思路和目标。

研究内容

1.USP39通过Wnt/β-catenin途径增加HCC细胞的增殖和迁移

为了阐明USP39是否调节HCC细胞中β-catenin的表达、细胞增殖、细胞周期和肿瘤生长，在HCC细胞系（SK-hep-1和PLC/PRF/5）中对USP39、β-catenin抑制剂ICG-001进行敲低和过表达。分别通过实时定量PCR（qRT-PCR）和Western blotting（WB）确认了USP39的敲低和互补的效率。HCC细胞的增殖能力是通过MTT和菌落形成实验评估的。MTT结果表明，与对照组相比，敲低USP39减少了HCC细胞的增殖，而补充USP39则恢复了HCC细胞的增殖。然而，当用ICG-001阻断wnt/β-catenin通路时，USP39的补充未能恢复HCC细胞的增殖。菌落形成试验表明，USP39敲低明显抑制了HCC细胞的菌落形成能力，这一效果通过补充USP39而得到恢复。然而，用ICG-001处理时，集落形成能力再次受到抑制。此外，伤口愈合实验表明，沉默USP39明显降低了HCC细胞的迁移能力，补充USP39可以挽救因沉默USP39而受损的迁移能力，而Wnt通路抑制剂ICG-001可以逆转这一现象。

研究结论：USP39通过Wnt/β-catenin途径增加HCC细胞的增殖和迁移。

2.USP39的缺失导致HCC中β-catenin的减少

USP39具有去泛素化和调节RNA剪接的功能，上述数据已经证明USP39通过Wnt/β-catenin途径增加HCC的进展。然而，目前仍不清楚USP39在这一过程中扮演何种角色。为了确定USP39是如何调节β-catenin的，研究人员对敲低或过量表达USP39的肝癌细胞进行了β-catenin mRNA水平的qRT-PCR分析。研究人员发现USP39的缺失或过表达使β-catenin mRNA水平没有变化。相反，Western blotting显示，敲低USP39导致β-catenin的减少，而过表达USP39增加了HCC细胞中的β-catenin蛋白水平。此外，SK-hep-1的免疫荧光染色显示，外源性USP39和β-catenin在细胞核中共同定位。通过西方印迹法检测从细胞质和细胞核中分离出来的蛋白质显示，敲低USP39诱发了细胞核β-catenin的减少，而USP39的过表达增加了细胞核中的β-catenin水平。此外，USP39通过激活Wnt信号的相关基因，包括Axin、GSK3β、c-Myc和CyclinD1，发挥其致癌特性。

研究结论：USP39影响了Wnt/β-catenin途径的活性。

3.USP39通过去泛素化稳定β-catenin蛋白

考虑到β-catenin蛋白水平下降而mRNA水平没有变化，而USP39是一种去泛素化酶，研究人员假设USP39是否会去泛素化并稳定β-catenin。为了验证这一点，研究人员首先在PLC/RCF/5细胞中通过免疫沉淀证明USP39和β-catenin之间存在结合。为了进一步确定USP39是否延长了β-catenin的半衰期，在用蛋白抑制剂环己酮（CHX）处理后的不同时间点监测β-catenin。在没有新蛋白合成的情况下，SK-hep-1细胞中的内源性β-catenin蛋白的半衰期要比对照组短。相反，USP39的过度表达延长了PLC/RCF/5细胞中β-catenin的半衰期。

为了进一步确认β-catenin的减少是否是通过泛素-蛋白体途径介导的，用蛋白体抑制剂MG132处理细胞。正如预期的那样，在用MG132处理的USP39敲低的SK-hep-1细胞中，β-catenin的下调被极大地逆转了。此外，免疫沉淀表明，USP39减少了SK-hep-1细胞中β-catenin的泛素化。GST下拉试验进一步证明，USP39可以在体外使β-catenin去泛素化。

研究结论：USP39与β-catenin直接相互作用，并调节β-catenin的泛素化，参与HCC的进展。

4.TRIM26参与USP39调控β-catenin，然后影响HCC的进展

考虑到β-catenin被证明是去泛素酶USP39的底物，而研究人员以前的研究表明TRIM26平衡了USP39对其底物的调节，因此研究人员假设TRIM26在USP39稳定β-catenin的过程中也发挥了同样的作用。为了证明这一假设，研究人员分别产生了USP39敲低、TRIM26敲低和双敲低的细胞系。结果显示，敲低USP39导致HCC细胞中的β-catenin明显减少，而USP39和TRIM26双敲低与只敲低USP39赤字相比，明显补充了β-catenin水平。此外，USP39的过表达增加了β-catenin蛋白水平，但USP39和TRIM26的共同表达抵消了这种增加。敲低USP39、TRIM26或两者，通过Western blotting检测从细胞质和核中分离的蛋白，显示USP39和TRIM26共同影响了β-catenin的入核。

根据研究人员以前的发现，TRIM26减少了HCC细胞的增殖和迁移。这里，为了探究TRIM26是否通过β-catenin调节HCC的进展，研究人员产生了TRIM26和β-catenin敲低的HCC细胞系，并通过qRT-PCR和WB证实了敲低效率。MTT实验显示，当用敲低β-catenin或ICG-001处理细胞时，TRIM26敲低诱导的HCC细胞的增殖被废除。一致的是，菌落形成实验显示，敲低TRIM26后克隆数量明显增加，而这种增加可以通过β-catenin抑制剂ICG-001来缓解。此外，transwell和伤口愈合试验显示，敲低TRIM26增加了HCC的迁移，当用ICG-001抑制Wnt信号时，这种影响被消除。

为了研究ICG-001对CRC转移的影响，研究人员在裸体小鼠中进行了肝外转移模型。结果显示，与对照组相比，注射了TRIM26基因敲低的SK-hep-1细胞的小鼠表现出更严重的肝转移。ICG-001治疗明显缓解了TRIM26敲低组和对照组的肝脏转移生长。为了评估TRIM26和β-catenin在体内HCC进展中的影响，将TRIM26和β-catenin敲低的SK-hep-1细胞分别注射到BALB/c裸鼠的腹部。HCC细胞中TRIM26表达的下调明显促进了肿瘤的生长，肿瘤的体积更大。相比之下，shTRIM26+shβ-catenin细胞组的肿瘤要比注射NC细胞的对照组小得多。shTRIM26组的肿瘤中β-catenin的免疫组化染色显示了较高的表达水平。

研究结论：TRIM26通过WNT信号通路在体内和体外都能抑制HCC细胞的增殖和迁移。

5.USP39调控TRIM26 mRNA前体剪接

研究人员以前的研究表明，去泛素酶USP39和E3连接酶TRIM26以拮抗而非竞争的模式发挥作用，并在控制ZEB1的稳定性以决定HCC的进展中发挥关键作用。然而，USP39和TRIM26之间是否存在调节仍不清楚。

在这项研究中，研究人员注意到敲低USP39诱导TRIM26蛋白水平的增加。为了探索这背后的机制，研究人员过度表达和敲低USP39，发现当CHX抑制新蛋白合成时，对TRIM26的半衰期没有影响。此外，TRIM26的泛素化水平不受敲低USP39的影响。在USP39过表达的SK-hep-1细胞中，TRIM26的mRNA表达被下调。

据报道，USP39参与了mRNA前体剪接和成熟。基于研究人员之前的RNA测序研究，富集的GO分析表明，USP39敲低或过表达后，结肠癌细胞HCT116中差异表达的基因主要与RNA剪接的功能有关。在人类结肠癌细胞中使用USP39敲低或过表达后，发现了许多重要的差异剪接事件。此外，rMATS分析表明TRIM26 mRNA的第4外显子存在明显的变化，研究人员在第4外显子附近设计了两对引物来检测组成型剪接mRNA和替代型剪接mRNA。

研究人员首先用qRT-PCR检测了USP39对TRIM26mRNA水平的影响，发现敲低USP39会增加TRIM26的转录水平。使用两对引物，一个用于替代性剪接，另一个用于TRIM26 mRNA的组成性剪接，研究人员证实敲低USP39会增加TRIM26mRNA的替代性剪接，而组成性剪接则不会。此外，USP39的过量表达减少了TRIM26mRNA的替代剪接，而对组成剪接没有影响。RIP试验也证实USP39与TRIM26的mRNA结合。

研究结论：USP39调节TRIM26 mRNA前体的剪接和成熟，并导致TRIM26蛋白水平下降，至少部分是通过抑制其mRNA前体的剪接。

6.TRIM26通过泛素化调控β-catenin

由于TRIM26具有泛素连接酶的活性，研究人员探讨了TRIM26是否泛素化和稳定β-catenin蛋白。进行qRT-PCR显示，无论TRIM26敲低还是过表达，β-catenin mRNA都保持在与对照组相似的水平，排除了β-catenin蛋白上调来自转录的可能性。尽管如此，TRIM26缺陷的HCC细胞显示出β-catenin和Wnt相关蛋白水平的显著增加，而TRIM26过表达则导致相反的趋势。双重免疫荧光染色显示在HCC细胞中TRIM26和β-catenin之间存在共定位现象。为了确定是细胞质还是细胞核的β-catenin蛋白减少，研究人员分离了细胞质和核蛋白，并通过Western blotting检查，证明敲低TRIM26后，细胞核和细胞质中的β-catenin蛋白水平都有所提高。上述数据表明，TRIM26对β-catenin的转录水平没有影响。

为了研究TRIM26是否影响β-catenin的稳定性，进行了CHX抑制新蛋白的合成。结果显示，TRIM26的敲低延长了β-catenin的半衰期。一致的是，TRIM26的过度表达缩短了β-catenin的半衰期。研究人员还观察到，TRIM26的过表达降低了β-catenin蛋白的水平，而MG132通过对蛋白酶体途径的抑制阻止了这一现象。最后，免疫沉淀实验证实，TRIM26敲低降低了β-catenin的泛素化水平。相反，TRIM26的过表达促进了β-catenin的泛素化。此外，GST下拉实验证明，TRIM26直接增加了β-catenin的泛素化水平。

研究结论：USP39对β-catenin进行去泛素化，并抑制TRIM26 mRNA前体的成熟，进一步影响其蛋白水平，减少其对β-catenin的泛素化，这在促进HCC进展中起着关键作用。

结论与讨论

由于TRIM26的E3泛素连接酶活性，研究人员认为TRIM26具有促进β-catenin泛素化和降解的功能。免疫荧光实验显示TRIM26和β-catenin共定位，免疫沉淀实验证实TRIM26直接与β-catenin结合。最后，通过免疫沉淀和GST pull-down实验，研究人员证明TRIM26在HCC细胞中对β-catenin进行泛素化。总之，研究人员的实验数据支持USP39通过TRIM26/β-catenin轴调节HCC细胞增殖和迁移的机制。这一机制的阐明将为肝细胞癌药物的开发提供新的线索。

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全文链接：https://www.nature.com/articles/s41419-023-05593-7

来源：拆塔科学