摘要：母乳中的 α-乳清蛋白（α-LA）是婴儿生长发育的关键营养来源，但其大规模生产长期依赖动物提取，存在过敏风险且与人类蛋白差异显著。近年来，微生物合成技术为解决这一难题提供了新思路，然而常用宿主毕赤酵母的传统甲醇诱导系统存在毒性高、工艺复杂等瓶颈。
母乳中的 α-乳清蛋白（α-LA）是婴儿生长发育的关键营养来源，但其大规模生产长期依赖动物提取，存在过敏风险且与人类蛋白差异显著。近年来，微生物合成技术为解决这一难题提供了新思路，然而常用宿主毕赤酵母的传统甲醇诱导系统存在毒性高、工艺复杂等瓶颈。
近日，江南大学刘延峰团队通过创新代谢工程策略，首次在毕赤酵母中构建了高效、安全的乙醇诱导系统，成功实现人源 α-LA 的无甲醇生产。这项研究成果以“Ethanol-Inducible Bioproduction of Human α-Lactalbumin in Komagataella phaffii”为题发表在 Journal of Agricultural and Food Chemistry 上，摇瓶发酵产量达 16.52 mg/L，3 L 生物反应器扩大后进一步提升至 0.6 g/L，为工业化应用铺平道路。
传统毕赤酵母系统中，甲醇既是碳源也是诱导剂，但其毒性会抑制细胞生长，甚至导致蛋白错误折叠。针对这一痛点，研究团队借鉴合成生物学工具，设计了乙醇诱导转录信号放大装置（ESAD）的基因线路。该系统由两部分组成：一是由乙醇激活的“感应开关”——ICL1 启动子，用于控制融合蛋白 LacI-Mit1AD 的表达；二是经过改造的“执行元件”——包含多拷贝 lacO 序列的 AOX1 核心启动子，直接驱动 α-LA 基因表达。当乙醇存在时，ICL1 启动子启动，LacI-Mit1AD 蛋白精准结合 lacO 位点，使得 AOX1 核心启动子启动转录。通过逐步增加 lacO 拷贝数，团队发现含 5 个 lacO 的菌株（ESAD-5LA）产量达 10.20 mg/L，较单拷贝菌株提升 38%，且细胞在乙醇环境中的生长速度显著优于甲醇体系，OD600 值高出 20% 以上。这一突破不仅摆脱了甲醇依赖，还意外发现乙醇代谢能为细胞提供更高能量，为后续优化埋下伏笔。
图 | 基于 PAOX1 构建的无甲醇表达系统的构建和性能
蛋白质分泌效率是工业化生产的关键。α-LA 需穿过细胞膜进入培养液才能高效回收，而这一过程依赖信号肽的“导航”功能。传统 α-factor 信号肽虽广泛使用，但其效率有限。团队创新性地提出“杂交信号肽”策略，将 14 种不同来源的信号肽进行模块化拼接，优化 N 端信号识别区与 C 端加工区的组合。例如，将血清白蛋白信号肽的 N 端与 α-factor 的 C 端融合后，新设计的 P4 型信号肽使 α-LA 产量从 10 mg/L 提升至 12.68 mg/L，提升 26.8%。进一步分析发现，P4 型信号肽结构边界更清晰，能更高效地将 α-LA 引导至分泌途径，减少蛋白在细胞内的“滞留损耗”。这种“即插即用”的信号肽设计思路，为其他难分泌蛋白的生产提供了通用解决方案。
随着表达与分泌难题的攻克，团队开始探索如何通过基因剂量提升产量。在毕赤酵母中，多拷贝整合是常用策略，但基因副本过多会导致细胞“超负荷”。研究显示，携带 3 个 α-LA 基因拷贝的菌株（LA-3C）摇瓶产量达 16.52 mg/L，但当拷贝数增至 7 个时，产量反而暴跌至接近零。这一现象揭示了细胞代谢的“临界点”：过多基因副本会透支细胞的能量与资源，触发内质网应激反应，激活蛋白质降解机制。团队通过荧光定量 PCR 发现，3 拷贝菌株的 α-LA mRNA 水平是单拷贝的 17 倍，但 7 拷贝菌株的 mRNA 虽更高，蛋白产量却骤降，推测与错误折叠蛋白被内质网批量清除有关。这一发现提示，未来可通过同步强化蛋白折叠辅助因子，突破多拷贝瓶颈。
从摇瓶到生物反应器的放大过程中，团队发现，乙醇代谢产生的乙酸在发酵液中快速堆积，峰值浓度达 134.77 g/L，严重抑制细胞活性。为此，团队引入聚磷酸激酶（SePPK），通过补充六偏磷酸钠（SHMP）再生 ATP，为乙酸代谢“充电”。同时，将发酵液 pH 调至 3，抑制胞外蛋白酶对 α-LA 的降解。双管齐下后，乙酸积累被完全消除，目标蛋白产量至 0.6 g/L。
图 | 高效价多拷贝 α-乳白蛋白生产菌株的筛选及 3 L 生物反应器中的补料分批发酵
这项研究不仅首次在毕赤酵母中实现了 α-LA 的无甲醇生产，更通过多维度创新将产量提升至工业化潜力水平。与传统甲醇系统相比，乙醇诱导的工艺安全性更高、能耗更低，且 0.6 g/L 的生物反应器产量较此前报道的甲醇体系（113.4 mg/L）提升超 5 倍。团队表示，未来将进一步解析毕赤酵母的蛋白酶网络，通过基因编辑减少蛋白降解，推动这一绿色生产技术从实验室迈向婴儿配方奶粉与医疗产品的生产线。
参考链接：
1.Wang X, Zhang X, Mao Y, et al. Ethanol-inducible bioproduction of human α-lactalbumin in Komagataella phaffii[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2025.
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来源：生辉SciPhi