摘要：铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）是一种革兰氏阴性菌，广泛分布于土壤、动植物、临床等环境。在临床环境中，铜绿假单胞菌已成为引发革兰氏阴性菌感染的重要原因，尤其在宿主免疫系统受损的患者中更为常见。作为常见的条件致病菌之一，由铜绿假单胞菌

单位：南京大学生命科学学院

简介：杨帆，女，河北张家口人，硕士研究生，研究方向：植物与微生物的基因演化。*通信作者，副教授，博士，硕士生导师，从事植物与微生物的基因演化研究。

来源：《安徽农业科学》2025年4期

引文格式：杨帆,沈威,王强.铜绿假单胞菌核糖体蛋白YggL的演化与功能分析[J].安徽农业科学,2025,53(4):77-85,102.

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铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）是一种革兰氏阴性菌，广泛分布于土壤、动植物、临床等环境。在临床环境中，铜绿假单胞菌已成为引发革兰氏阴性菌感染的重要原因，尤其在宿主免疫系统受损的患者中更为常见。作为常见的条件致病菌之一，由铜绿假单胞菌造成的医院感染比例高达10.1%，可导致呼吸道、烧伤创面、泌尿道等严重感染，与许多疾病的高发病率和死亡率有关。铜绿假单胞菌的基因组为5.5~7.0Mbp，比大多数细菌都要大。为了适应多元的生存环境，铜绿假单胞菌可通过祖先复制或者从其他物种水平基因转移的方式来获得更多与环境适应性相关的基因。

生物的核糖体是由大、小两个亚基组成的复合结构，每个亚基包括核糖体RNA（rRNA）和多个核糖体蛋白（RPs）。原核生物的70S核糖体由30S小亚基和50S大亚基组成，其中30S亚基由1个16S rRNA和约21种蛋白质组成，而50S亚基由5S、23S rRNA和31种蛋白质组成。在细菌中，核糖体蛋白不仅与核糖体形成和蛋白质翻译有关，还可以影响细胞生命活动的其他过程，如生长发育、细胞凋亡和衰老等。同时作为许多重要抗生素的靶标，核糖体蛋白在医学领域的研究至关重要。随着生物技术的不断进步和发展，人们对于核糖体蛋白的认识逐渐深入。有研究报道，一个新发现的核糖体蛋白YggL是大肠杆菌核糖体大亚基的组成部分，影响大小亚基组装成完整核糖体，拓展了对核糖体结构和功能的了解。

目的

探究铜绿假单胞菌核糖体蛋白的进化来源和潜在的功能差异，发掘其适应复杂环境及获得耐药性的分子机制。

方法

以公共数据库中15个原核模式生物的代表性菌株、假单胞菌属及其近缘属75个物种的代表性菌株以及708个铜绿假单胞菌的基因组为研究对象，分析含有2个拷贝的核糖体蛋白YggL的基因，并探讨其演化历程。

结果

◆核糖体蛋白YggL在细菌中的分布情况

为全面了解核糖体蛋白在细菌中的存在情况，选取来自厚壁菌门、放线菌门、衣原体门和变形菌门中15个模式生物的代表性菌株，观察了RPG数据库收录的模式生物大肠杆菌的53个核糖体蛋白及近年来新发现的核糖体蛋白YggL在这些菌株中的分布模式。与其他代表性菌株只存在1个拷贝不同，在铜绿假单胞菌模式菌株PAO1中，核糖体蛋白L31、L36和YggL均鉴定到2个不同的拷贝（图1A）。此前的研究已经明确，铜绿假单胞菌编码L31和L36的基因位点均存在2个拷贝的现象，并对二者的演化历程进行了探究，认为L31和L36第2个拷贝的来源可能由于水平基因转移事件导致，但难以排除变形菌进化基础上的复制。值得注意的是，YggL基因也含有2个拷贝为该研究发现的现象。

注：A.15个模式菌株中核糖体蛋白的鉴定，以不同颜色标明基因的拷贝数。B.15个模式菌株的系统发育树（左）和3类核糖体蛋白的进化树（右）。YggL、L31与L36各有2个拷贝，以绿色、棕色、红色、黄色、蓝色、粉色分别框出，以突出显示。

图1 核糖体蛋白的鉴定及YggL、L31与L36的进化树

通过构建15个模式菌株的系统发育树和3个核糖体蛋白的进化树，笔者发现YggL、L31与L36具有不同的分布模式。相比于同属于γ-变形菌纲的大肠杆菌（Escherichia coli）、肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）只含有1个YggL的情况，铜绿假单胞菌模式菌株PAO1基因组中含有2个YggL。与YggL不同，L31与L36分布十分广泛，不仅存在于γ-变形菌纲中，在厚壁菌门的金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、放线菌门的结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）、衣原体门的沙眼衣原体（Chlamydia trachomatis）等不同门类中也有所分布，且能够在大肠杆菌、铜绿假单胞菌、肠道沙门氏菌（Salmonella enterica）鉴定出多个不同的L31和L36（图1B）。为便于描述，笔者将3类核糖体蛋白中存在于多数菌株的分支称为Clade I，只存在于少数菌株的核糖体蛋白分支称为Clade II。Clade I YggL由PA3046编码，Clade II YggL由PA1842编码；Clade I L31由PA5049/rpmE编码，Clade II L31由PA3601编码；Clade I L36由PA4242/rpmJ编码，Clade II L36由PA3600编码。

在铜绿假单胞菌708个完全组装的基因组中，该研究共鉴定出1415个YggL，1414个L31和1415个L36，表明这3类核糖体蛋白的双拷贝现象在铜绿假单胞菌菌株中稳定存在（表1）。这有助于继续深入研究核糖体蛋白额外拷贝的起源、功能分化特性及其对生物适应性的意义。

为了验证1415个YggL，1414个L31和1415个L36在708株铜绿假单胞菌中是否均匀分布，该研究分别构建了这3类核糖体蛋白的系统发育树。结果显示，YggL、L31和L36的2个拷贝均匀分布在2个支系中（图2A）。除了最为典型的PAO1菌株外，该研究还选取了假单胞菌属基因组数据库注释的4个常见菌株PAK、PA7、UCBPP_PA14和LESB58，观察其在系统发育树上的分布并加以标注。值得注意的是，PA7来源于铜绿假单胞菌离群分支（outlier clade），虽然有研究建议将这些异常菌株归类为新的物种——副铜绿假单胞菌（Pseudomonas paraeruginosa），但目前文献中对这些铜绿假单胞菌离群菌株的分类仍存在争议，该研究仍视PA7为铜绿假单胞菌。

注：A.708个铜绿假单胞菌菌株中YggL、L31与L36的进化树结构。绿色代表YggL分支1，棕色代表YggL分支2，红色代表L31分支1，黄色代表L31分支2，蓝色代表L36分支1，粉色代表L36分支2。B.铜绿假单胞菌YggL、L31与L36的泛基因组分析。点（球）表示基因家族，连线对应基因组共定位关系，灰色节点表示位于持久（persistent）或核心（core）基因组，即几乎所有基因组中存在的基因家族；橙色节点表示位于壳（shell）或附属（accessory）基因组，即在物种中以中等频率存在的基因家族。铜绿假单胞菌模式菌株PAO1中3类核糖体蛋白的Clade I和Clade II分别用不同颜色突出显示。

图2 铜绿假单胞菌中YggL、L31与L36的进化树结构及泛基因组分析

为进一步探究该现象在708个铜绿假单胞菌菌株中是否具有普遍性，进行了铜绿假单胞菌的泛基因组分析。与Clade I YggL、L31和L36各自的2个拷贝不同，Clade II YggL附近存在1个与基因组保守性或特定的分布模式相关的壳基因（shell gene），并未在群体中固定下来，反映了其所在的基因座的不稳定性（图2B）。因此，推测YggL第2个拷贝的产生与保留可能是由于近期受到了环境的影响，是铜绿假单胞菌适应环境的选择。

◆铜绿假单胞菌2个YggL的演化来源

该研究试图追踪YggL基因2个拷贝的演化起源，对其所在的假单胞菌属、近缘的固氮菌属和Stutzerimonas属（Pseudomonas stutzeri新被划分至其中）共74个物种构建了属水平的系统发育树（图3A左）和YggL蛋白的进化树（图3A右）。该研究发现，尽管某些假单胞菌部分菌株YggL的拷贝数大于1.0（表1），但其代表性菌株仅拥有单拷贝，说明大部分假单胞菌物种并非稳定拥有2个YggL，体现了铜绿假单胞菌的特殊性。3类Clade I核糖体蛋白的基因树与假单胞菌属水平的物种树结构一致；3类Clade II的核糖体蛋白只在少量的物种中分布，Clade II YggL在5个物种中分布，Clade II L31在30个物种中分布，Clade II L36在7个物种中分布。基于基因树与物种树拓扑结构的相似性，判断3类Clade I的核糖体蛋白来源于祖先继承，而3类Clade II的核糖体蛋白的多拷贝现象在属内的物种分布并非完全一致（图3A）。

注：A.假单胞菌属的系统发育树（左）和3类核糖体蛋白的进化树（右）。范围涵盖假单胞菌属及其同科的固氮菌属、Stutzerimonas属共74个物种，以Burkholderia multivorans为外类群。由于篇幅原因，将与铜绿假单胞菌亲缘关系较远的物种折叠起来。B.γ-变形菌纲水平YggL的进化树。下方框为与铜绿假单胞菌PAO1 2个YggL亲缘关系较近的蛋白所在分支的清晰展示。C.Clade I YggL与Clade II YggL的共线性分析。箭头表示基因，相同颜色的箭头表示有相似性的基因。连线的颜色越深，一致性越高。选取基因区域范围为每个分支YggL上、下游各8000bp左右。

图3 YggL更广泛的演化谱系

为进一步确认铜绿假单胞菌YggL第2个拷贝的来源，该研究在NR库进行了检索，发现YggL仅存在于γ-变形菌纲内，因此构建了整个γ-变形菌纲的YggL进化树。与Clade I YggL和Clade II YggL相邻的其他家族的YggL被当作潜在靶标，并在方框中清晰展示（图3B），用于探究铜绿假单胞菌YggL额外拷贝的可能来源。共线性分析结果显示，YggL的2个拷贝及其同源基因均表现出良好的同源性和相似性，Clade II YggL只存在于假单胞菌及其固氮菌属的近缘物种Azotobacter vinelandii中，并未找到其可能来源的远缘物种。因此，难以明确YggL第2个拷贝是来源于自身基因组中祖先基因的复制还是其他物种水平的基因转移（图3C）。

◆铜绿假单胞菌中2个YggL的功能分析

基于结构决定功能这一普遍认知，为深入探究2个YggL之间的功能异同，该研究利用ColabFold对其结构进行了预测，发现Clade I YggL与Clade II YggL之间的结构相似性较低，且存在明显差异，暗示着Clade II YggL的出现可能会导致核糖体的三维结构发生改变（图4）。

图4 铜绿假单胞菌PAO1 Clade I YggL和Clade II YggL结构

通过统计表达谱数据集（表2）中36个测试条件下3类核糖体蛋白的表达情况，发现在阿奇霉素、妥布霉素、黏菌素、庆大霉素4种不同抗生素处理的条件下，Clade II YggL、Clade II L31及Clade II L36的表达量显著降低，且Clade II YggL对抗生素可能更为敏感（双尾Mann-Whitney检验，P

注：**表示PP

图5 铜绿假单胞菌PAO1 YggL、L31和L36 2个拷贝在4种抗生素及其他条件下的表达情况

除上述抗生素条件会改变几个核糖体蛋白的表达量外，并未发现其他条件能明显区分几类核糖体蛋白的表达情况。因此，该研究采取加权基因共表达网络分析（WGCNA）的方法，利用基因表达数据构建网络，旨在预测Clade II YggL的功能以及识别与其共表达的关键基因，从而深入了解YggL多拷贝现象在铜绿假单胞菌中的功能和重要性。笔者将36个测试条件排列组合得到7 773个条件组合，设定共表达次数大于阈值平均值加2倍标准差（μ+2σ）来筛选与3类核糖体蛋白显著共表达的基因（图6）。

注：红色虚线标注的位置代表正态分布的平均值加2倍标准差，公式表示用于筛选最显著共表达基因临界值的设定。

图6 铜绿假单胞菌PAO1中YggL、L31和L36 2个拷贝共表达基因的密度分布

统计结果显示，在该标准下，与Clade I YggL存在相同表达趋势的基因总计199个，与Clade II YggL存在相同表达趋势的基因总计236个（图7）。

图7 YggL、L31和L36共表达基因韦恩图

2个YggL共表达基因的交集仅有43个，2个拷贝之间并未观察到共表达关系（图8）。特别值得注意的是，作为核糖体蛋白，Clade II YggL与Clade II L31及Clade II L36之间存在共同表达的现象，与Clade II YggL共表达的236个基因中有133个与Clade II L36的共表达基因一致，有109个与Clade I L31的共表达基因一致。在Clade II L31与Clade II L36之间也发现了明显的共表达现象（图8）。这与之前观察到的抗生素处理条件下基因表达量降低的现象相吻合，可能是由于三者均受到了抗生素的抑制，提示此三者可能共同表达，行使一致的生物学功能（图5，表3）。GO富集分析发现，Clade II YggL与Clade II L31、Clade II YggL与Clade II L36以及Clade II L31与Clade II L36共同共表达的基因参与跨膜转运等生物学过程，且与膜相关的细胞组分、跨膜转运蛋白的功能有关（图8）。

图8 铜绿假单胞菌PAO1 Clade II YggL与Clade II 31、Clade II YggL与Clade II 36以及Clade II 31与Clade II L36共表达基因一致部分的GO富集分析和KEGG聚类分析

KEGG的结果也表明，在铜绿假单胞菌中，Clade II YggL与ABC转运蛋白存在共表达现象。经检验，与Clade II YggL、Clade II L31以及Clade II L36共表达的基因与编码膜蛋白的基因显著相关（图9）。考虑到膜蛋白折叠通常需要特殊的条件，该研究推测Clade II YggL、Clade II L31与Clade II L36可能通过改变核糖体状态为膜蛋白创造一个更好的折叠条件，因此始终同膜蛋白基因共表达。

注：**表示PP

图9 铜绿假单胞菌PAO1 YggL、L31和L36 2个拷贝共表达基因中与膜蛋白相关基因的数目

结论

在铜绿假单胞菌中，相比于Clade I YggL，Clade II YggL在抗生素处理下表达量显著降低，且与同属于核糖体大亚基组成蛋白的Clade II L31、Clade II L36共同表达。与Clade II YggL共表达的基因与膜蛋白紧密关联，编码核糖体蛋白的基因多拷贝现象可能通过影响核糖体状态，从而为膜蛋白折叠和转运提供更好的条件。

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采编：小白

排版：小同

来源：安徽农业科学